Regulation der Expression von multiple drug resistance (mdr) Effluxpumpen in klinisch relevanten Salmonella-Stämmen

Abstract

Gastrointestinale Infektionskrankheiten, die durch Mikroorganismen der Gattung Salmonella verursacht werden, gehören weltweit zu den häufigsten bakteriellen Erkrankungen. Zur Therapie werden vor allem Fluorchinolone als Inhibitoren der bakteriellen Topoisomerasen eingesetzt. Resistenzen gegenüber Fluorchinolonen entstehen durch Mutationen in den Targetgenen gyrA, gyrB, parC und parE, welche für die Untereinheiten der Topoisomerase II und IV kodieren. Darüber hinaus führt eine verringerte Akkumulation, durch reduzierten Influx oder erhöhten Efflux, der Antibiotika in der Zelle zu einer verringerten Empfindlichkeit. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Beitrag geleistet werden zu der Beantwortung der Frage nach der Entstehung Efflux-vermittelter Fluorchinolon-Resistenz in Salmonella spec. Anhand von In-vitro-Mutanten sowie von klinischen Isolaten sollte untersucht werden welche Effluxpumpen bzw. Regulatoren, nach erhöhter Genexpression, zu einer Verringerung der Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antbiotika beitragen. Darüber hinaus sollte die Frage beantwortet werden wie in Salmonella spec. die Regulation dieser Effluxpumpen auf globaler Ebene stattfindet. Zunächst wurden In-vitro-Zweitschritt-Mutanten, welche aus einem Selektionsversuch mit Fluorchinolonen hervorgegangen sind, näher charakterisiert. Die MHK-Werte der Fluorchinolone und von Chloramphenicol waren im Vergleich zu den Werten der Erstschritt-Mutanten erhöht und sanken in Anwesenheit eines Effluxpumpeninhibitors deutlich ab, woraus sich die Hypothese ergab, dass erhöhter Efflux in diesen Stämmen für die verringerte Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika verantwortlich ist. Anschließend wurde versucht, mittels eines globalen Ansatzes, der Erstellung einer chromosomalen Genbank einer In-vitro-Zweitschritt-Mutante, einen möglichen, für die Verringerung der Antibiotika-Empfindlichkeiten verantwortlichen, positiven Regulator oder eine Effluxpumpe zu identifizieren. Zur gezielten Untersuchung der Expression für Effluxpumpen bzw. globale Regulatoren kodierender Gene mittels quantitativer real-time PCR wurden mögliche Kandidaten anhand von Aminosäure-Sequenzalignments ausgewählt. In den Zweitschritt-Mutanten von S. Hadar und S. Typhimurium war die Expression der RND-Effluxpumpen AcrAB-TolC, AcrEF-TolC und YegMNO-TolC im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp deutlich erhöht. In den Stämmen von S. Hadar konnte zudem eine Expressionssteigerung der MATE-Effluxpumpe YdhE beobachtet werden. Ursächlich für die Expressionserhöhung der genannten Effluxpumpen ist die in allen Stämmen beobachtete starke Aufregulation des Regulatorgens rma. In klinischen Isolaten von Salmonella spec., die erhöhte Unempfindlichkeiten gegenüber verschiedenen Antibiotika zeigten, wurde ebenfalls eine deutliche Expressionserhöhung von rma beobachtet. Eine weitere allgemeinere Frage war die nach der Regulation von Effluxpumpen in Salmonella spec. auf globaler Ebene. Zur Beantwortung dieser Frage wurden Induktions- bzw. Überexpressionsexperimente durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass eine Auswahl strukturell unterschiedlicher Fluorchinolone keine induzierende Wirkung auf die Expression des Effluxpumpengens acrA sowie des Regulatorgens marA hat. Die Fluorchinolone als Substrate der Effluxpumpen führen demnach weder direkt, noch indirekt über eine Veränderung des Superspiralisierungsgrades zu einer verstärkten Pumpen- bzw. Regulatorenexpression. Zudem wurde gezielt die Expression der globalen Regulatoren MarA, SoxS, Rob sowie Rma gesteigert, um die als Folge dessen veränderte Expression von Effluxpumpen und Regulatoren zu bestimmen. Die RND-Pumpen AcrAB-TolC, AcrEF-TolC und YegMNO-TolC werden über jeden der vier globalen Regulatoren angesprochen. MarA reguliert zudem positiv die Expression von emrAB (MFS-Familie), ydhE (MATE-Familie) und offenbar auch die des globalen Regulatorgens rma, während SoxS zusätzlich positiv auf die Expression von ydhE und marA einwirkt. Phänotypisch führte die Überexpression der Regulatorgene rma und rob zu deutlich verringerten Empfindlichkeiten gegenüber verschiedenen Antibiotika. Zusammenfassend verdeutlichen diese Überexpressions- und Induktionsversuche, dass die Kontrolle von Effluxpumpen in Salmonella spec. einer sehr komplexen Regulation unterliegt, an der ein Netzwerk von Regulatoren beteiligt ist. Dem globalen Regulator Rma scheint dabei in Salmonella spec. eine wesentlichere Rolle zuzukommen als bisher angenommen wurde. Besonders die Ergebnisse aus den Versuchen mit den In-vitro-Mutanten deuten darauf hin, dass eine übergeordnete Kontrolle existiert, die Einfluss auf die Expression der globalen Regulatoren nimmt. Diese Untersuchungen zur Regulation von Effluxpumpen in Antibiotika-unempfindlichen Stämmen sind von großem Interesse für das Verständnis der Resistenzentwicklung bzw. –vermeidung bei Salmonella spec. sowie für die Entwicklung neuer, auf der Ebene des bakteriellen Effluxes wirksamen, Chemotherapeutika.

Gastrointestinal infectious diseases, caused by salmonellae, belong to the most frequent bacterial diseases throughout the world. To combat those infections especially fluoroquinolones, as inhibitors of bacterial topoisomerases, are applied. Resistance to fluoroquinolones develops through mutations in the target genes gyrA, gyrB, parC and parE, which encode the subunits of topoisomerases II and IV. Additionally decreased accumulation of the antibiotics in the cell, via reduced influx or increased efflux, leads to decreased susceptibilities. Within this paper a contribution should be made to answer the issue of the development of efflux mediated fluoroquinolone resistance in Salmonella spec. On the basis of in vitro mutants as well as clinical isolates it should be analysed which efflux pumps and regulators contribute to decreased susceptibilities to various antibiotics. Additionally the issue was addressed how these efflux pumps are regulated globally. First of all second step mutants, selected on fluoroquinolones, were characterised. (1.) MIC-values of fluoroquinolones and of chloramphenicol were increased compared to the first step selection mutants, and decreased in the presence of an efflux pump inhibitor. Hence it was hypothesised that enhanced efflux is responsible for the decreased susceptibilities to various antibiotics in these strains. (2.) Sequence analyses of local regulator genes acrR and soxR, of global regulator gene rma as well as of parts of the efflux pump genes acrAB showed no differences between wildtyps, first and second step selection mutants. Obviously other genetic alterations are responsible for decreased antibiotic susceptibilities in the second step selection mutants. (3.) Determination of doubling times showed a slight increase in the first step selection mutants, due to mutations in the target genes, and a minor decrease in the second step selection mutants. Thus the mutation, which occurred in the second selection step leads to a marginal fitness compensation. Subsequently it was tried to identify a putative positive regulator or an efflux pump, which might be responsible for the decreased antibiotic susceptibilities, via chromosomal shotgun-cloning. For selective determination of gene expression of efflux pumps and global regulators, using quantitative real-time PCR, possible candidates were chosen on the basis of amino acid sequence alignments. Second step selection mutants of S. Hadar and S. Typhimurium showed considerably increased expression of RND-type efflux pumps AcrAB-TolC, AcrEF-TolC and YegMNO-TolC compared to the respective wildtyps. The S. Hadar strains also showed increased expression of the MATE-type efflux pump YdhE. Responsible for the mentioned increases in efflux pump expression is the considerable upregulation of the global regulator gene rma. In clinical isolates of Salmonella spec., which displayed enhanced resistance to various antibiotics, an obvious increase in rma expression has also been observed. Another issue was the global regulation of efflux pumps in Salmonella spec. To answer this question induction- and overexpression experiments have been performed. It was shown that various structurally diverse fluoroquinolones did not lead to any expression change of the efflux pump gene acrA and the global regulator gene marA respectively. Thus fluoroquinolones, as substrates of efflux pumps, do not lead to an increase in efflux pump or regulator expression, neither directly nor via a change in the supercoiling degree. Additionally the expression of global regulators MarA, SoxS, Rob and Rma has been enhanced specifically to determine resulting expression changes of efflux pump and regulator genes. The RND-type efflux pumps AcrAB-TolC, AcrEF-TolC and YegMNO-TolC are addressed via each of the above mentioned global regulators. MarA additionally activates the expression of emrAB (MFS-family), ydhE (MATE-family) and obviously also the expression of the global regulator rma, whereas SoxS moreover positively affects the expression of ydhE and marA. Phenotypically the overexpression of the global regulator genes rma and rob led to considerably decreased susceptibilities to various antibiotics. Recapitulating these overexpression- and induction experiments point out that the control of efflux pumps in Salmonella spec. is subjected to a complex regulatory network to which various regulators contribute. Thereby the global regulator Rma seems to play a more fundamental role than previously thought. Especially the findings from the experiments with the in vitro mutants indicate that a superior regulator exists which controls the expression of the global regulators. These investigations concerning the regulation of efflux pumps in unsusceptible strains are of major interest for understanding resistance development and avoidance in Salmonella spec. as well as the development of new chemotherapeutics, which act on the level of bacterial efflux.