Das cyclische ADP-Ribose Analogon cyclische 8-Br-IDP-Ribose : Darstellung, Stabilität und Charakterisierung in T-Lymphozyten des Menschen (H. sapiens)

Abstract

Cyclische ADP-Ribose (cADPR) ist ein calciummobilisierender second Messenger der bei T-Lymphozyten an der Erzeugung des langanhaltenden Calciumsignals beteiligt ist und vermutlich zur effizienten Aktivierung von T-Zellen beiträgt. Zur näheren Untersuchung des cADPR vermittelten Calciumsignals wurden bereits viele cADPR Analoga synthetisiert und ihre Eigenschaften analysiert und beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das cADPR Analogon cyclische 8-Br-IDP-Ribose (8-Br-cIDPR) synthetisiert, aufgereinigt und seine metabolische Stabilität, der Effekt auf die Proliferation und das durch 8-Br-cIDPR vermittelte Calciumsignal näher untersucht. Die erfolgreiche Synthese von 8-Br-cIDPR erfolgte durch Umsetzung von 8-Br-NHD durch die ADP-Ribosyl Cyclase (ADPRC) von A. californica, wobei zur Aufreinigung von 8-Br-cIDPR eine neue Strategie entwickelt wurde. Die Reinheit und Identität des Produkts konnten durch RP-HPLC- und massenspektroskopische Analyse gezeigt werden. Die metabolische Stabilität von 8-Br-cIDPR und von weiteren Hypoxanthin-basierten cADPR Analoga wie cIDPR, cIDPRE und cIDP-DE wurde gegenüber der ADPRC CD38 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Analoga im Gegensatz zu cADPR gegenüber CD38 stabil sind, was sie für weitere Untersuchungen des cADPR vermittelten Calciumsignals, aber auch als Leitstruktur für die Entwicklung weiterer Analoga interessant erscheinen lässt. Die Stabilität dieser cADPR Analoga beruht auf einem formellen Austausch der Nukleobase Adenin gegen Hypoxanthin und führt zu einer verminderten Nucleophilie und Reaktivität des N1-Atoms. In weiteren Studien wurde der Effekt dieser stabilen cADPR Agonisten und von cADPR selbst auf die Proliferation von Jurkat T-Lymphozyten untersucht. 8-Br-cIDPR und cADPR hatten keinen Einfluss auf die Proliferation, während cIDPR, cIDPRE und cIDP-DE zur Inhibition der Proliferation führten. Der inhibitorische Effekt von cIDPR war am stärksten ausgeprägt und wurde an anderen autonom wachsenden Lymphom- und Myelomzelllinen sowie an primären Ratten T-Zellen überprüft. Ein inhibitorischer Effekt auf die Proliferation konnte aber nur bei einigen Lymphomzelllinien beobachtet werden, so dass vermutet wurde, dass es sich um einen zellspezifischen Effekt handelt. Die Untersuchung des 8-Br-cIDPR vermittelten Calciumsignals zeigte eine Beteiligung von 8-Br-cIDPR sowohl an der Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern als auch am Einstrom von Calcium aus dem extrazellulär Raum. So konnte mit Hilfe des „Calcium free/Calcium readdition“-Protokolls gezeigt werden, dass 8-Br-cIDPR während der calciumfreien Phase (extrazelluläre Calciumkonzentration = 0 mM) zu einer Freisetzung von Calcium führte. Nach Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration auf 1 mM konnte nachfolgend ein starker Einstrom beobachtet werden. Der Einstrom konnte durch die Calciumkanalblocker Gadoliniumchlorid und SKF96365 inhibiert werden, während die Freisetzung leicht erhöht oder unbeeinflusst war. Die Freisetzung konnte durch den Ryanodinrezeptor Antagonisten Ruthenium Rot zum Teil inhibiert werden. Ein unerwartetes Ergebnis wurde mit dem cADPR Antagonisten 8-Br-cADPR (cyclische 8-Br-ADP-Ribose) erhalten, hier konnte beobachtet werden, dass die Freisetzung nur schwach, der Einstrom aber stark inhibiert wurde. Da zuvor durch eine andere Arbeitsgruppe gezeigt wurde, dass cADPR gemeinsam mit ADP-Ribose aktivierend auf den Natrium/Calcium-Kationenkanal TRPM2 (transient receptor potential - melastatin like) wirkt, wurde vermutet, dass die durch 8-Br-cADPR vermittelte Inhibition des Einstroms auf die Inhibition des TRPM2-Kanals zurückzuführen war. Der durch 8-Br-cIDPR vermittelte Einstrom wird also vermutlich zu einem großen Teil durch TRPM2-Kanäle und weniger durch die CRAC (calcium release activated calcium)-Kanäle vermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass sich bei 8-Br-cIDPR um ein membranpermanten, metabolisch stabilen cADPR Agonisten handelt, der zur Freisetzung als auch zum Einstrom von Calcium führt.