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Titel: Identifizierung und molekulare Charakterisierung von Zielproteinen von Mono-ADP-Ribosyltransferasen (ARTs)
Sonstige Titel: Identification and molecular characterization of mono-ADP-ribosyltransferases (ARTs)
Sprache: Deutsch
Autor*in: Koestner, Wolfgang
Schlagwörter: Neuropilin-1; Dec-205; etheno-NAD; Mono-ADP-Ribosyltransferase; ART; etheno-NAD; mono-ADP-ribosyltransferase; ART
GND-Schlagwörter: NAD-ADP-Ribosyltransferase; Antigen CD38; NAD
Erscheinungsdatum: 2007
Tag der mündlichen Prüfung: 2008-02-19
Zusammenfassung: 
Mono-ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) sind Enzyme, die NAD unter Freisetzung von Nicotinamid spalten und den Transfer von ADP-Ribose auf Zielproteine katalysieren. Bekannte bakterielle ARTs sind z.B. Cholera- und Pertussistoxin, die die Signaltransduktion in Wirtszellen durch ADP-Ribosylierung von G-Proteinen hemmen. Toxin-verwandte eukaryotische ARTs inhibieren elementare Zellfunktionen auf Lymphozyten. Ziel dieser Arbeit war es, Zielproteine eukaryotischer ARTs zu identifizieren und zu charakterisieren, die den Ausgangspunkt für das Verständnis der Wirkung von ARTs in T-Zellen bilden könnten. Zu diesem Zweck wurde ein Antikörper-basierter Assay zum Nachweis von ADPRibosylierung auf der Zelloberfläche etabliert. Unter Verwendung eines mit einer etheno-Gruppe modifizierten NADs (etheno-NAD) und unter Verwendung des für etheno-Adenosin spezifischen Antikörpers 1G4 wurden etheno-ADP-ribosylierte Zielproteine im FACS und im Westernblot dargestellt. Durch massenspektroskopische Untersuchung von 1G4-Immunpräzipitaten gelang der Nachweis neuer ART-Zielproteine. Im Westernblot konnte die ADP-Riboslylierung bekannter Zielproteine wie LFA-1, CD44 und CD45 bestätigt werden. Außerdem wurde erstmals humanes CD8als Zielprotein von hART1 in vitro nachgewiesen. Daneben wurde untersucht, inwiefern der enzymatische Abbau durch das NAD verstoffwechselnde Ektoenzym CD38 die Verfügbarkeit von extrazellulärem NAD als Substrat für hART1 begrenzt. Dabei konnte eine CD38 vermittelte Hemmung der ADP-Ribosylierung in cis nachgewiesen werden. Mittels massenspektroskopischer Analyse konnten DEC-205 und Neuropillin-1 als neue Zielproteine von ARTs identifiziert werden. Des Weiteren wurden Hsp 70 und Hsp 90 als mögliche Interaktionspartner von ARTZielproteinen identifiziert. Um Schnittstellen zwischen ART-Zielproteinen und der Signaltransduktion von T-Zellen herzustellen, wurden Interaktionen zwischen Zielproteinen von ARTs und Tyrosinkinasen untersucht. Tatsächlich zeigten sich zahlreiche solcher Interaktionen in primären Maus T-Zellen. Es fanden sich ferner Hinweise darauf, dass zwei dieser Proteine mit Molekulargewichten von ca. 64 und 80 kDa in die frühe Signaltransduktion von T-Zellen involviert sein könnten. Die Identifizierung dieser Proteine erscheint vielversprechend, um die Beziehung zwischen ART-Zielproteinen und der T-Zell-Signaltransduktion zu verstehen. Zusammengefasst bieten die neu identifizierten Zielproteine wichtige Grundlagen, um die Effekte eukaryotischer ARTs aufklären zu können.

Mono-ADP-ribosyltransferases (ARTs) are enzymes, which cleave NAD and catalyse the transfer from ADP-ribose onto target proteins while nicotinamid is released. Well known bacterial toxins are ARTs such as cholera- or pertussistoxin, who inhibit the signal transduction through ADP-ribosylation of G proteins. Toxinrelated eukaryotic ARTs suppress elementary cell functions of T lymphocytes. The aim of this work was to identify and to characterise target proteins of eukaryotic ARTs as a starting point to understand these ART mediated mechanisms. Therefore an antibody-based assay to detect ADP-ribosylation was established. An antibody specific for etheno-adenosine could identify etheno-ADP-ribosylated target proteins in FACS- and western blot analysis using etheno-NAD as a substrate. The method was validated on known target proteins in western blot analysis and used to identify new target proteins using mass spectrometry. It could be shown that human CD8-alpha can be modified by human ART1 in vitro as has been seen for mouse CD8-alpha before. The influence of the NAD ectoenzyme CD38 on ADPribosylation was analysed. A CD38 mediated inhibition of ADP-ribosylation in cis could be demonstrated. Using mass spectrometry analysis DEC-205 and Neuropillin- 1 could be identified as new target proteins of ARTs. Furthermore Hsp 70 und Hsp 90 were determined as possible interacting with ART-target proteins. To locate interfaces in the signal transduction interactions between ART targets and tyrosine kinases were analysed. Indeed several of such interactions could be detected in primary mouse T cells. Two of these interacting proteins with molecular weights of about 64 and 80 kDa seemed to be involved in the early signal transduction of T cells. The identification of these targets holds promise to understand the relationship of ART target proteins and T cell signal transduction.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/2047
URN: urn:nbn:de:gbv:18-36160
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Haag, Friedrich (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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