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Titel: Epigenetische Funktion des mutierten Tumorsuppressors p53 in humanen Mammakarzinoma
Sonstige Titel: The epigenetic function of mutant p53 in human mamma carcinoma
Sprache: Deutsch
Autor*in: Tögel, Lars
Erscheinungsdatum: 2007
Tag der mündlichen Prüfung: 2008-02-01
Zusammenfassung: 
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den auf der Interaktion mit Nukleinsäure basierenden Wirkmechanismus von endogen exprimierten mutp53-Proteinen in humanen Mammakarzinom-Zelllinien zu charakterisieren. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Methode etabliert, welche die Chromatin Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung der präzipitierten Sequenzen koppelt (ChIP-Seq). Diese Methode ermöglichte die Identifikation einiger mutp53-Bindestellen in den Zelllinien MDAMB231 und MDAMB468. Die bioinformatische Analyse der Bindestellen ergab, dass zwei Drittel der Sequenzen in intergenischen Regionen des Genoms lokalisiert sind und hauptsächlich repetitive DNA-Elemente beinhalten. Eine allgemeingültige Nukleotid-Konsensus-Sequenz konnte nicht identifiziert werden. Da repetitive Elemente, wie beispielsweise LINEs und SINEs, der DNA strukturelle Flexibilität verleihen, wird die Interaktion von mutp53 mit DNA vermutlich über eine Struktur-selektive Bindung (DSSB) reguliert. Der Struktur-selektive Bindungsmechanismus ist möglicherweise auch für Wechselwirkungen von mutp53 bzw. wtp53 mit RNA verantwortlich. Im zweiten Teil der Arbeit wurde daraufhin
mittels RNA Immunpräzipitation (RIP) und anschließender bioinformatischer Analyse der präzipitierten Transkripte potentielle Interaktionen von mutp53 bzw. wtp53 mit RNA untersucht. Die Analyse ergab, dass sowohl mutp53 als auch wtp53 präferentiell mit verkürzten Transkripten oder nicht kodierenden RNAs (ncRNA) interagiert. In spezifischen Analysen wurden Transkripte von bestimmten wtp53-Zielgenen auf ihre Assoziation mit wtp53-Proteinen hin untersucht. In der Tat konnte die Interaktion mit einigen Transkripten dieser Gene nachgewiesen werden. Zur Entschlüsselung der biologischen Relevanz der mutp53-Expression in MDAMB231 und MDAMB468 Zellen sollte das Protein durch RNAi stabil ausgeschaltet werden. Dieser Ansatz war jedoch nicht erfolgreich, da exogene RNAs in diesen Zellen vermutlich einen durch die dsRNA-abhängige Protein Kinase (PKR) vermittelten Stopp der Proteinbiosynthese induzieren, was den Zellzyklusarrest und Zelltod zur Folge hat. Durch mutp53 würden freie RNAs gebunden und somit eine Induktion der PKR verhindert. In der transienten Überexpression von shRNAs konnte eine erhöhte Transkription von mutp53 festgestellt werden. Dies ist ein Hinweis darauf, dass mutp53 auch zur Regulierung der globalen Konzentration freier RNA gebildet wird.
Zusammenfassend lässt sich mutp53 als neuer epigenetischer Faktor klassifizieren und folgendes Modell für die biologische Funktion von mutp53 in der Tumorzelle postulieren: durch die Bindung von mutp53-Proteinen an repetitive DNA-Regionen kommt es zu einer globalen Veränderung der Chromatinarchitektur. Dadurch wird die Rekrutierung von funktionell gekoppelten Genen an transkriptionell aktive Multiprotein-Komplexe ermöglicht. An diesen Komplexen kann die koordinierte Transkription der Gene und eine RNA Prozessierung stattfinden. Eine neue und wesentliche Komponente der postulierten übergeordneten Regulation der Genexpression ist die RNA-Bindekapazität von mutp53. Die Entfernung von mutp53 aus diesem ausgeglichenen System oder die Überexpression von exogenen RNAs verschiebt die fein abgestimmten Balance zwischen Protein-gebundenen und freien RNAs mit drastischen Folgen für die Proliferation der Krebszelle.

The aim of this work was to characterize the function of endogenously expressed mutp53 in breast cancer cell lines depending on its interaction with nucleic acids. In the first part of this work a method was established which couples chromatin immunoprecipitation (ChIP) with subsequent bioinformatic analysis of the precipitated
sequences (ChIP-Seq). Using this method it was possible to identify several mutp53 binding sites in the human breast cancer cell lines MDAMB231 and MDAMB468. Two thirds of the
identified sequences were located in intergenic regions and contained mainly repetitive DNA elements. No common nucleotide binding sequence was evident. However, as repetitive DNA elements such as LINEs and SINEs are known to endow DNA with structural flexibility, the
interaction of mutp53 with DNA is probably dependent on specific DNA topology (DNA structure-selective binding, DSSB). DSSB might also be crucial for the interaction of mutp53 and/or wtp53 with RNA.
To analyze such potential interactions, RNA Immunoprecipitation (RIP) and subsequent bioinformatic analysis of the precipitated transcripts was applied in the second part of this work. This revealed that both mutp53 and wtp53 preferentially interact with truncated transcripts or non-coding RNAs (ncRNA). In further experiments the interaction of wtp53 proteins with transcripts of specific target genes was examined. Indeed, transcripts of some of these genes were found to be bound by wtp53. To understand the biological relevance of the mutp53 expression in MDAMB231 and MDAMB468 cells, it was attempted to stably switch off the protein by RNAi. However, this approach was not successful, possibly due to activation of dsRNA dependent protein kinase(PKR)by exogenous RNAs which mediates the shutdown of protein biosynthesis, consequently leading to cell cycle arrest and cell death. Mutp53 would bind free RNAs and thereby prevent induction of PKR. Transient overexpression of shRNAs led to upregulation of mutp53 transcription, indicating that mutp53 is produced for the regulation of the global
concentration of free RNA.
In summary, mutp53 can be classified as a new epigenetic factor and the following model for the biological function of mutp53 in the tumor cell is postulated: Binding of mutp53 to repetitive DNA elements causes a global change in the chromatin architecture. Thereby, the physical recruitment of functionally coupled genes to transcriptionally active multi-protein complexes is facilitated. At these complexes, both coordinated transcription of the respective genes as well as RNA processing can occur. In this setting, the RNA-binding capacity of mutp53 represents a novel and important component involved in the postulated higher order regulation of gene expression. Removal of mutp53 from this equilibrated system, or overexpression of exogeneous RNAs interrupts the delicate balance between protein-bound
and free RNA, resulting in drastic consequences for the proliferation of the tumor cell.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/2061
URN: urn:nbn:de:gbv:18-36295
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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