| Zusammenfassung: | Die Nukleotide Adenosintriphosphat (ATP) und Nikotinamidadenosindinukleotid (NAD+) nehmen, neben ihrer Rolle als Schlüsselmetabolite des intrazellulären Energiestoffwechsels, weitere Funktionen als extrazelluläre Signalmoleküle ein. Eines ihrer Zielproteine ist der P2X7-Ionen Kanal, der auf einer Vielzahl von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Er kann sowohl durch seinen löslichen Liganden A... Die Nukleotide Adenosintriphosphat (ATP) und Nikotinamidadenosindinukleotid (NAD+) nehmen, neben ihrer Rolle als Schlüsselmetabolite des intrazellulären Energiestoffwechsels, weitere Funktionen als extrazelluläre Signalmoleküle ein. Eines ihrer Zielproteine ist der P2X7-Ionen Kanal, der auf einer Vielzahl von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Er kann sowohl durch seinen löslichen Liganden ATP als auch durch NAD-abhängige ADP-Ribosylierung aktiviert werden. Diese kovalente Modifikation wird durch die murine ADP-Ribosyltransferase ART2.2 katalysiert, die die ADP-Ribosegruppe von NAD+ auf Argininreste verschiedener Membranproteine überträgt. Die extrazelluläre Domäne des P2X7-Rezeptors enthält elf Argininreste, die in Maus-, Ratten- und humanen P2X7 konserviert sind. Die funktionale Signifikanz dieser Argininreste wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand von transfizierten HEK-Zellen, die den Wildtyp oder Arginin>Lysin Substitutionsmutanten des P2X7-Rezeptors, alleine oder in Kombination mit der ART2.2 exprimierten, untersucht. Zwei Mutanten (R294K und R307K) zeigten drastisch verminderte Calciumantworten auf ATP, drei Mutanten (R206K, R76K, R277K) eine deutlich erhöhte Sensibilität gegenüber ATP und NAD-abhängige ADP-Ribosylierung. Arginin 125 wurde als die ADP-Ribosylierungstelle identifiziert, durch die der P2X7-Rezeptor aktiviert wird.
Die vorliegende Arbeit beschreibt ferner die Effekte der P2X7-Aktivierung im HEK-Zellmodell und bei primären, murinen T-Zellen durch ATP oder durch ART2.2-vermittelte ADP-Ribosylierung. Die Aktivierung des Rezeptors bedingt in transfizierten HEK-Zellen den Influx von Calcium, blasige Ausstülpungen der Zellmembran (membrane-„blebbing“), gefolgt von einer raschen Exposition von Phosphatidylserin (PS) und der Aufnahme von Yo-Pro-1. Bei T-Zellen kommt es zur PS-Exposition, dem Verlust von CD62L, CD27 und schließlich zur Aufnahme von Propidiumiodid (PI). Eine Behandlung von naiven T-Zellen mit ATP oder NAD+ bedingt die Phagozytose dieser Zellen durch Peritonealmakrophagen. Dabei kann eine positive Korrelation zwischen der Phagozytose der behandelten T-Zellen und der PS-Exposition auf der Außenseite der T-Zellmembran beobachtet werden.
Der P2X7-Rezeptor zeigt eine 40-fach höhere Sensitivität gegenüber NAD+ als gegenüber ATP. Die Freisetzung von endogenem NAD+ bei der Ernte von HEK-Zellen sowie bei der Präparation von primären T-Zellen verursacht bereits eine Aktivierung des P2X7 auf einem Teil der Zellen. Im Fall von primären T-Zellen kann dies durch intravenöse Injektion von ART2.2-blockierenden Einzeldomänenantikörpern 10 Minuten vor der Präparation der Lymphozyten verhindert werden.
The nucleotides adenosine triphosphate (ATP) and nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD+) function as extracellular signaling molecules in addition to their roles as key metabolites of intracellular metabolism. One of the ATP and NAD responsive receptors is the ligand-gated P2X7 ion channel, which is expressed on a number of cells of hematopoietic origin. The P2X7-receptor can be activated eithe... The nucleotides adenosine triphosphate (ATP) and nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD+) function as extracellular signaling molecules in addition to their roles as key metabolites of intracellular metabolism. One of the ATP and NAD responsive receptors is the ligand-gated P2X7 ion channel, which is expressed on a number of cells of hematopoietic origin. The P2X7-receptor can be activated either directly by its soluble ligand ATP, or indirectly by NAD-dependent ADP-ribosylation. The latter post translational modification is catalyzed by murine ADP-ribosyltransferase ART2.2, which transfers the ADP-ribosyl moiety from NAD+ to target arginine residues in membrane proteins. The extracellular domain of the P2X7-receptor contains 11 arginine residues which are conserved in P2X7 of mice, rats and humans. In this work, the functional significance of these arginine residues was investigated in transfected HEK-cells expressing wildtype P2X7 or arginine to lysine P2X7 mutants either alone or in combination with ART2.2. Two mutants (R294K and R307K) showed drastically reduced calcium responses to ATP, while three mutants (R206K, R276K and R277K) showed enhanced sensitivities to ATP and to NAD-dependent ADP-ribosylation. Arginine 125 was identified as the ADP-ribosylation site by which the P2X7-receptor is activated.
This thesis describes the effects of activation of P2X7 by ATP or by ART2.2-mediated ADP-ribosylation in a HEK-cell model as well as in primary murine T-cells. In transfected HEK-cells, activation of the receptor triggers an influx of calcium, membrane-“blebbing” followed by a rapid exposure of phosphatidylserine (PS) and the uptake of Yo-Pro-1. T-cells respond to P2X7 activation with PS-exposure, loss of CD62 and CD27 and finally, the uptake of propidium iodide (PI). Treatment of naïve T-cells with ATP or NAD+ prompts their phagocytosis by peritoneal macrophages. Here, a positive correlation between the phagocytosis of nucleotide treated T-cells and PS-exposure by these cells was observed.
The P2X7-receptor shows a 40-fold higher sensitivity to NAD+ than to ATP. During the harvesting of HEK-cells and during preparation of primary T-cells enough NAD+ is released to allow ART2.2-mediated activation of the receptor on a fraction of cells. In case of T cells, this can be prevented by the intravenous injection of ART2.2-blocking single domain antibodies 10 min prior to cell preparation. |
