Evaluation von Zielsequenzen zur RNA Interferenz gegen den Proteinphosphatase-Inhibitor-1 und den Beta1-Adrenozeptor

Abstract

Der Erfolg von Betablockern in der Therapie der Herzinsuffizienz legt nahe, Therapieprinzipien zu testen, die ihren primären Angriffspunkt innerhalb des Kardiomyozyten haben und dort die beta-adrenerge Signalkaskade partiell hemmen („intrazelluläre partielle Beta-Blockade“). Das Abschwächen (Knockdown) von Inhibitor-1 könnte diesbezüglich eine interessante Option sein, da (1.) dieses Protein den beta-adrenergen Signalweg verstärkt, (2.) es in der menschlichen Herzinsuffizienz wie auch die Beta1-Adrenozeptoren stark vermindert ist und (3.) das genetische Fehlen von Inhibitor-1 in Mäusen vor Katecholamin induzierten Arrhythmien und Herzhypertrophie schützt, ohne sichtbare negative Auswirkungen zu haben. Bis jetzt ist jedoch eine spezifische pharmakologische Beeinflussung von Inhibitor-1 nicht möglich. Ziel der Arbeit war es deshalb, in vitro die Grundlage dafür zu schaffen, die Wirksamkeit einer herzspezifischen Genabschaltung von Inhibitor-1 im Tiermodell zu testen und dies mit einer Genabschaltung des Beta1-Adrenozeptors zu vergleichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst hochspezifische siRNA-Sequenzen gegen Inhibitor-1 und den Beta1-Adrenozeptor in silico konstruiert und dann kommerziell synthetisiert. Anschließend wurde die biologische Effizienz dieser Sequenzen in Form von exogen applizierter siRNA und endogen produzierter shRNA in verschiedenen Zellsystemen getestet. Für optimale Testbedingungen wurden zuvor mehrere stabile Zelllinien erzeugt, die jeweils eines der beiden Proteine überexprimieren. Die Knockdown Effekte wurden sowohl auf mRNA- (mittels quantitativer Echtzeit PCR) als auf Proteinebene (mittels Western Blot bzw. Bindungsassays) gemessen und auf die Effekte einer wirkungslosen Kontroll-siRNA normalisiert. Übereinstimmend mit der Literatur zeigte sich das shRNA System in der spezifischen Herunterregulation von Inhibitor-1 und Beta1-Adrenozeptor dem siRNA System überlegen. Hier konnten die mRNA- und Proteinkonzentration von Inhibitor-1 und Beta1-Adrenozeptor mit bestimmten shRNAs um bis zu 80% reproduzierbar reduziert werden. Diese hocheffizienten spezifischen shRNAs sollen nun im Rahmen von adenoviral-assoziierter (AAV-) shRNA-Expression in vivo in der experimentellen Herzinsuffizienz getestet werden und somit zur Beantwortung der Frage, ob die Herunterregulation von Inhibitor-1 eine mögliche Therapieoption in der Herzinsuffizienz darstellt und wie diese im Vergleich zu einer Herunterregulation des Beta1-Adrenozeptors zu bewerten ist, beitragen.