Vitamin B12 Production during Tofu Fermentation by Lactobacillus reuteri and Propionibacterium freudenreichii

Abstract

The present work is concerning the vitamin B12 enrichment in tofu by submerged solid substrate fermentations with L. reuteri and P. freudenreichii. After screening, eight strains of bacteria were confirmed to be able to produce vitamin B12 in tofu. L. reuteri was considered the best strain to carry out further experiments. The optimization of nitrogen source, moisture, time of fermentation, and carbon source had been performed. An appropriate co-fermentation with glucose, fructose, and glycerol can improve cobalamin production by balancing the redox reaction. After further optimizations by a fractional factorial design, a steeptest ascent design and a central composite design, 16.33 ± 0.58 ng/g (wet weight) of cobalamin were produced by fermentation in 100 gram of tofu supplemented with 16.41 g/kg of glucose, 0.7 g/kg of glycerol, 1.5 g/kg of fructose, 2.5 mg/kg of CoCl2, 3.5 mg/kg of Dmbi, and 100 mL DDW at 37 °C for 3 days. A cofermentation with L. reuteri and P. freudenreichii was applied because the cooperation of L. reuteri and P. freudenreichii can improve vitamin B12 production in tofu. A series of fermentation supplementations and conditions were screened and optimized. Riboflavin, betaine, Dmbi, glycine, glucose, fructose, and glycerol supplementations have been proven to have significantly positive effects on vitamin B12 production. Riboflavin can replace Dmbi to produce vitamin B12 under at least 4-day anaerobic fementations for L. reuteri. Supplementations of riboflavin after 2-day fermentations have been proven to improve vitamin B12 production as it can avoid an inhibitory riboswitch feedback of vitamin B12. Conditions of initial pH values, fermentation temperature, oxygen supply, and inoculum titers have also been optimized. Optimum initial pH values were between 6.5 and 7.0. 30°C was the optimum fermentation temperature. The last 2-day aerobic fermentation can afford enough oxygen to convert riboflavin to Dmbi for P. freudenreichii. Unlike Emmental cheeses, high vitamin B12 production can be found only if 5*107 of both bacteria were inoculated simultaneously. After a series of single factor experiments and FFD experiments, 90 ng/g of vitamin B12 (wet weight) were produced in 100 gram of tofu fermentations supplemented with 0.5 g/kg glucose, 0.1 g/kg fructose, 80 µg/kg riboflavin, 1 mg/kg cobalt chloride, and 0.5 g/kg betaine. Batch fermentations of 1 kg tofu were successfully conducted based on above conditions. Supplementations of 5 g/kg glucose cannot only produce more cobalamin, but also alleviate the catabolic repression. Fed batch fermentations obviously improved vitamin B12 production. In particular, a fed batch supplemented with 1 gram glucose every day produced almost 289 ng/g of vitamin B12. Fermentations with natural substances have also been performed to produce 179 ng/g of vitamin B12. After breeding experiments were perfomed by inoculating bacteria in vitamin B12 test broths supplemented with heme for 20 generations, Strains can produce 2 fold more vitamin B12 than before. Optimizations of tofu whey as preculture media for both bacteria were successfully perfomed. As the vitamin B12 content in fermented tofu was almost the same as in meat, fermented tofu can be recognized as a potential alternative diet for vegetarians.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Anreicherung von Vitamin B12 in Tofu durch eine Fermentation von Tofu mit Lactobacillus reuteri und Propionibacterium freudenreichii untersucht. Nach einem „Screening“ konnte gezeigt werden, dass 8 Bakterienstämme die Fähigkeit besitzen in Tofu Vitamin B12 zu bilden. Da sich L. reuteri als der am besten geeignete Stamm herausstellte, wurden die weiteren Untersuchungen mit diesem Stamm durchgeführt. Es wurden Optimierungsversuche für die Parameter: Fermentationsdauer, Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Feuchtigkeitsgehalt (Wassergehalt) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, das eine Co-Fermentation aus L. reuteri und P. freudenreichii nach einer Optimierung der Zusätze an Glucose, Fructose und Glycerin durch eine Balance des Redox-Gleichgewichtes geeignet ist die Vitamin B12-Produktion in Tofu zu steigern. Nach weiteren Optimierungen durch ein „fractional fractorial design“, ein „steepest ascent design“ und ein „central composite design“ konnten 16,33 ± 0,58 ng/g (Naßgewicht) Cobalamin erreicht werden. Dazu wurden 100g Tofu mit 16,41 g/kg Glucose, 1,5 g/kg Fructose, 0,7 g/kg Glycerin, 2,5 mg/kg CoCl2, 3,5 mg/kg Dimethylbenzimidazol und 100mL entmineralisiertem Wasser für 3 Tage bei 37°C fermentiert. Es wurde eine Co-Fermentation mit L. reuteri und P. freudenreichii durchgeführt, da die Kooperation der beiden Stämme die Vitamin-B12-Produktion in Tofu verbessert. Nach der eingehenden Prüfung unterschiedlicher Fermentationssupplementierungen und unterschiedlicher Fermentationsbedingungen konnte gezeigt werden, dass Riboflavin, Betain, Dimethylbenzimidazol, Glycin, Glycerin, Glucose und Fructose Supplementierungen eindeutig positive Effekte auf die Vitamin-B12-Produktion in Tofu haben. Unter den Bedingungen einer mindestens viertägigen anaeroben Fermentation für Lactobacillus reuteri kann Riboflavin Dimethylbenzimidazol als Vorstufe für die Vitamin-B12-Produktion ersetzen. Es konnte gezeigt werden, dass Riboflavin-Supplementierungen, die nach einer zweitägigen Fermentationszeit erfolgten, die Vitamin-B12-Produktion verbesserten, da so ein hemmender „Riboswitch“ durch eine Vitamin-B12-Rückkopplungshemmung (feedback inhibiton) vermieden werden konnte. Des Weiteren wurden die Parameter Ausgangs-pH-Wert, Fermentationstemperatur, Sauerstoffversorgung und Inokulumstiter optimiert. Der optimale Ausgangs-pH-Wert betrug zwischen 6,5 bis 7,0. Die optimale Fermentationstemperatur betrug 30°C. Eine anschließende zweitägige aerobe Fermentation kann eine ausreichende Sauerstoffversorgung für die Umwandlung von Riboflavin zu Dimethylbenzimidazol durch P. freudenreichii gewährleisten. Im Gegensatz zu Emmentaler Käse kann eine hohe Vitamin-B12-Produktion nur stattfinden, wenn beide Bakterienstämme gleichzeitig in einer Zellzahl von 5×107 Zellen pro mL zugegeben werden. Nach einer Reihe von Einzelfaktor-Experimenten und „fractional factorial design“ Experimenten konnten in 100g Tofu, die mit 0,5 g/kg an Glucose, 0,1 g/kg an Fructose, 80 µg/kg an Riboflavin, 1 mg/kg Cobaltchlorid und 0,5 g/kg an Betain supplementiert worden waren, 90 ng/g Vitamin B12 (Naßgewicht) produziert werden. Unter den beschriebenen Bedingungen wurden Batch-Fermentationen mit 1 kg Tofu erfolgreich durchgeführt. Supplementierungen von 5 g/kg Glucose führten nicht nur zu einer besseren Cobalamin-Produktion, sondern führten auch zu einer Abmilderung der Katabolitrepression. Fed-Batch-Fermentationen konnten die Vitamin-B12-Produktion deutlich steigern. Insbesondere führte eine Fed-Batch-Fermentation, bei der jeden Tag 1 g Glucose zugefüttert wurden, zu einer Vitamin-B12-Konzentration von 289 ng/g. Fermentationen, die mit natürlichen Substraten durchgeführt wurden, führten zu Vitamin-B12-Konzentrationen von 179 ng/g Tofu. Durch Kultivierungsexperimente, bei denen die für die Inokulation verwendeten Bakterienstämme über 20 Generationen in Vitamin-B12-Testbouillon angezogen worden waren, die mit Häm supplementiert worden war, konnte die Vitamin-B12-Produktion um das Doppelte gesteigert werden. Optimierungsversuche, die auf einem Tofu-Molke enthaltenden Anzuchtmedium beruhten, konnten für beide Bakterienstämme erfolgreich durchgeführt werden. Da der Vitamin-B12-Gehalt in fermentiertem Tofu in der gleichen Größenordnung liegt, wie der Vitamin-B12-Gehalt in Fleisch, kann fermentierter Tofu als potentieller Fleischersatz für Vegetarier angesehen werden.