Entwicklung von bioartifiziellem Herzgewebe aus parthenogenetischen Stammzellen der Maus (Mus musculus, Linnaeus, 1758)

Abstract

Parthenogenetische Stammzellen (PS-Zellen) können ohne Zerstörung potentiell lebensfähiger Embryonen und ohne genetische Modifikationen gewonnen werden.Diese sowohl ethischen als auch experimentellen Vorteile machen sie als Zellquelle für Anwendungen im Bereich der regenerativen Medizin interessant. Zusätzlich ist die reduzierte Genomvariabilität, vor allem in dem immunrelevanten MHC-Locus, attraktiv für therapeutische Optionen. Zu Beginn dieser Arbeit waren weder die Differenzierungskapazität noch die organtypische Funktionalität von PS-Zell-Derivaten gut beschrieben. Im Rahmen dieser Promotion wurden die Hypothesen überprüft, dass PS-Zellen vergleichbare Eigenschaften wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) aufweisen und prinzipiell als Herzmuskelzellquelle für Anwendungen wie das myokardiale Tissue Engineering und die myokardiale Rekonstitution in vivo infrage kommen.

Zur Überprüfung dieser Hypothesen wurden PS-Zell-Linien aus Wildtyp- und transgenen Mäusen (aMHC-EGFP; Myozyten-spezifische Expression des Reportergens EGFP) etabliert. Eine basale Charakterisierung der generierten PS-Zell-Linien zeigte, dass diese sich morphologisch sowie molekularbiologisch kaum von konventionellen ES-Zellen unterscheiden. Chromosomale Haplotyp- Homozygotie sowie uni-parentale Methylierungs-Signaturen belegten den parthenogenetischen Ursprung der generierten PS-Zell-Linien. Zelltypen aller drei Keimblätter (Ekto-, Endo- und Mesoderm) konnten nach in vitro Differenzierung von PS-Zellen und in vivo in Teratomgewebe detektiert, und somit Hinweise auf ein pluripotentes Differenzierungspotential gewonnen werden. Durch Anwendung transgener PS-Zell-Linien wurde die Aufreinigung von EGFP-positiven Herzmuskelzellen möglich. Dabei zeigten diese Zellen Eigenschaften von funktionellen Myozyten-Subtypen (Ventrikulär-, Atrial-, Purkinje- und Schrittmacher-ähnliche Myozyten). In chimären Mäusen konnte die Fähigkeit von PS-Zellen zur Entwicklung differenzierter Herzmuskelzellen bestätigt werden. Die funktionelle Integration von PS-Zell-Derivaten in ein myokardiales funktionelles Synzytium in vivo konnte durch synchrone Detektion von Änderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration in Abhängigkeit vom Kontraktionszyklus der Herzmuskelzellen sowohl in chimären Herzen als auch nach intramyokardialer Zelltransplantation nachgewiesen werden. Schließlich konnte die Fähigkeit zur Gewebebildung auch in einem in vitro Modell der Herzentwicklung, dem Engineered Heart Tissue (EHT), überprüft werden. Hierbei zeigte sich, dass myokardial-angereicherte PS-Zell-Derivate EHTs mit morphologischen und kontraktilen Eigenschaften von nativem Myokard bilden können. Um die Rolle von Nicht-Myozyten für die Entwicklung von EHTs zu untersuchen wurde ein alternatives ES-Zell-EHT-Modell etabliert. Hier zeigte sich, das Fibroblasten für die EHT-Entwicklung essentiell sind.

Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass PS-Zellen ähnliche biologische Eigenschaften wie ES-Zellen besitzen und dabei in der Lage sind, funktionelle Myozyten in vitro und in vivo zu generieren. Diese haben darüber hinaus die Fähigkeit, künstliche Herzgewebe in vitro zu bilden. Aufbauend auf diesen Befunden soll das therapeutische Potenzial in der regenerativen Medizin als auch die Anwendbarkeit für die pharmakologische Substanzentwicklung sowie entwicklungsbiologische Fragestellungen erprobt werden.

Parthenogenetic stem cells (PSCs) can be derived without destruction of viable embryos and without genomic modification. These ethical as well as experimental advantages make PSCs an interesting cell source for potential applications in regenerative medicine. Additionally, the reduced genomic variability mainly in the immunorelevant MHC-Locus seems to be an attractive therapeutic option. The aim of this study was to evaluate the hypothesis that murine PSCs exhibit similar developmental potency as murine embryonic stem cells (ESCs) and to investigate whether PSCs are capable of forming fully functional cardiomyocytes and multicellular heart tissue in vitro and in vivo.

To investigate this hypothesis murine PSCs from wildtype and transgenic mice (aMHC-EGFP; myocyte-specific expression of the reporter gene EGFP) were generated. PSCs showed a high similarity to ESCs with respect to their morphology, growth kinetics and expression of typical stemness markers. The parthenogenetic origin was demonstrated by genomic haplotype homozygosity and uni-parental methylation pattern of typical imprinting genes. Histological examination demonstrated the propensity of PSCs to develop into endo-, ectoand mesodermal cell types after in vitro as well as after in vivo differentiation (teratoma). Transgenic PSC-lines (A3 and A6:aMHC-EGFP) were used to further study mesodermal induction and PSC-derived myocyte purification. The latter facilitated an electrophysiological identification of ventricle-, atrial-, Purkinje-, and pacemaker-like parthenogenetic myocytes. Hearts from chimeric mice demonstrated EGFP-positive PSC-derivatives in different myocardial regions including AV-node, atria and ventricles in accordance with the documented in vitro differentiation capacity. Measurement of synchronous Ca2+-transients between PSC-derived and host myocytes in chimeric hearts as well as after intramyocardial cell transplantation provided direct proof of electrical integration in vivo. Cytokineinduction increased PSC-derived myocyte yield enabling the generation of synchronous contracting EHTs which morphological and functional properties of native myocardium. Furthermore, in an alternative ESC-model, it could be shown that not only myocytes but also fibroblasts are essential for the eneration of EHT.

Taken together, this study shows that PSCs exhibit similar biological properties as ESCs and can give rise to functional myocytes in vitro and in vivo. Moreover, EHT can be generated from PSCs. PSCs could, ultimately, present a new cell source for potential applications in regenerative medicine and could be exploited as a tool to study organ development.