Entwicklung einer Real-Time Multiplex PCR zum Nachweis von Salmonella, Shigella und Yersinia Spezies sowie Campylobacter jejuni im Stuhl

Abstract

Infektiöse Gastroenteritis gehört zu den wichtigsten Gesundheitsproblemen und betrifft gut ¾ der Weltbevölkerung. Außer Viren sind enteropathogene Bakterien die Hauptverursacher von Diarrhöen. In Deutschland stehen Campylobacter an der Spitze der an das RKI gemeldeten bakteriellen Enteritiserreger, gefolgt von Salmonellen, Yersinien und Shigellen. Bei Ausbrüchen muss die Infektionsquelle rasch identifiziert werden, um der weiteren Verbreitung Einhalt zu gebieten. Zur schnellen Diagnostik wurde eine Real-Time Multiplex PCR entwickelt, die in einem Reaktionsansatz gleichzeitig die vier wichtigsten bakteriellen Durchfallserreger bei Erwachsenen nachweisen kann. Auf der Grundlage bereits publizierter Gensequenzen wurden Primer und Sonden für die einzelnen Bakterien mit der primer3software entworfen. Anschließend erfolgte die Entwicklung und Optimierung eines PCR-Protokols für den Thermocycler RotorGene 6000. Danach wurde die Empfindlichkeit und Spezifität der Methode mittels bakterieller DNA aus Kultur sowie aus Stuhlproben, die mit definierten Bakteriensuspensionen versetzt worden waren, geprüft. 552 Stuhlproben aus dem klinischen Alltag und von Reiserückkehrern, wurden abschließend mit der neu entwickelten Real-Time Multiplex PCR untersucht und die Resultate mit den Ergebnissen der konventionellen mikrobiologischen Diagnostik verglichen. Die Ergebnisse der PCR, einschließlich DNA-Extraktion, liegen in weniger als vier Stunden vor. Die analytische Sensitivität für Salmonellen beträgt 4 x 104 cfu/ml, für Shigellen 3 x 105cfu/ml, für Campylobacter 3 x 103 cfu/ml und für Yersinien 4 x 105 cfu/ml. Bei den klinischen Proben lag die Sensitivität für Salmonellen bei 99 % (71/72), für Campylobacter jejuni bei 99 % (79/80), für Shigellen (11/11) und Yersinien (10/10) bei je 100 %. Andere gramnegative oder grampositive Keime wurden nicht nachgewiesen. In 12 % (40/339) der Proben detektierte die PCR zusätzlich Keime, die kulturell nicht nachgewiesen wurden. Die PCR könnte als zweckmäßige diagnostische Methode in Situationen eingesetzt werden, bei denen der Zeitfaktor eine Rolle spielt, wie z.B. bei Ausbruchsuntersuchungen, sowie für epidemiologische Fragestellungen

Objectives: Diarrhoea is a major health problem worldwide, affecting almost ¾ of the world's population. Apart from viruses, enteropathogenic bacteria are the main causes for diarrhoea. Among these, 64731 infections with Campylobacter, 42909 with Salmonella, 4352 with Yersinia and 575 with Shigella were notified to the health authorities. In outbreak situations, the source of infection should be identified rapidly to halt the spread. Therefore a one tube real-time multiplex PCR for the detection of Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. and Campylobacter jejuni has been developed. Methods: Based on published sequence data, primer and probes were designed with primer3 software. The PCR protocol for RotorGene 6000 (Corbett) was optimized, and the sensitivity was tested in DNA-templates from cultures and in spiked stool samples. 552 stool samples from travellers and in-patients were analysed. The results were compared with established microbiological methods (stool culture). Results: The PCR yielded results in less than 4 hours including the DNA-purification. The analytical sensitivity for Salmonella was 4 x 104 cfu/ml, for Campylobacter 3 x 103 cfu/ml, for Shigella 3 x 105 cfu/ml and for Yersinia 4 x 105 cfu/ml. The PCR was able to detect Salmonella in 71 out of 72 (99%), Campylobacter in 79 out of 80 (99 %), Shigella in 11 out of 11 and Yersinia in 10 out of 10 samples (100 %). In samples with negative stool cultures (339), the PCR detected a further 24 Shigella, one Salmonella and 15 Campylobacter infections, respectively (12 %). Other gram negative or gram positive bacteria did not give positive results. Conclusion: The PCR essay proved to be a sensitive and reliable tool for presumptive diagnosis of diarrhoea caused by bacterial pathogens. This method can be useful as a diagnostic tool in the field and outbreak investigations, as well as for fast individual presumptive diagnosis in the severely ill patient.