Aufbau eines reversen Genetiksystems für das SARS-Coronavirus und dessen Anwendung zur Charakterisierung einer natürlich aufgetretenen Deletion im SARS-Coronavirus Frankfurt-1

Abstract

Während der SARS- Pandemie im Jahr 2002/3 wurde aus einem in Frankfurt behandelten Patienten ein Prototyp SARS-Coronavirus isoliert (SARS-CoV Frankfurt-1). Im Gegensatz zu allen anderen SARS-CoV Strängen hat Frankfurt-1 eine 45-Nukleotid Deletion in der Transmembrandomäne des ORF7b. Um die Rolle dieses Proteins im Rahmen der Virusreplikation untersuchen zu können, wurde in dieser Arbeit ein cDNA Klon hergestellt, der für das gesmte SARS-CoV Genom kodiert. Aus von diesem Konstrukt ausgehend hergestellten RNA Transkripten konnte nach deren Elektroporation infektiöses Virus gewonnen werden, welches sich vom Wildtyp Virus nicht unterschied. Das vermutlich nächst verwandte Virus des Frankfurt-1 Strangs mit intaktem ORF7b wurde mit Hilfe dieses neuen reversen Genetiksystems rekonstruiert. In Zellkultur zeigte sich ein geringer Wachtumsvorteil für das deletierte Virus auf bestimmten Zelllinien gegenüber dem vermuteten Ursprungsvirus. Dieser Effekt war jedoch nicht mit Veränderungen der Interferon Induktion oder Interferonseketion durch die Viren verbunden. Auch bezüglich der Apoptose-Induktion konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Allerdings hatte das deletierte Virus einen Replikationsvorteil auf mit Interferon-beta vorbehandelten Zellkulturen. Außerdem erreichte das deletierte Virus höhere RNA-Kopienzahlen und Virus-Titer in den Lungen syrischer Goldhamster, welche intranasal infiziert wurden. Dadurch könnten frühere Beobachtungen einer erhöhten Virulenz von SARS-CoV Frankfurt-1 im Vergleich zu anderen SARS-CoV Strängen in Hamstern erklärt werden. Das SARS ORF7b Protein konnte als attenuierender Faktor im SARS-CoV Genom identifiziert werden. Da in dieser Arbeit das Hauptaugenmerk auf die frühe Phase der Infektion gelegt wurde, könnte ORF 7b somit während der Pandemie zu einer verspäteten Akkumulation der Viren in Infizierten beigetragen haben. Dieses könnte die Verbreitung des Virus in der Bevölkerung verlangsamt haben.

During the outbreak of SARS in 2002/3, a prototype virus was isolated from a patient in Frankfurt/Germany (strain Frankfurt-1). As opposed to all other SARS-Coronavirus strains, Frankfurt-1 has a 45-nucleotide deletion in the transmembrane domain of its ORF7b protein. To study the role of ORF 7b in the context of virus replication, a full genome cDNA copy of strain Frankfurt-1 was generated. Transfection of capped RNA transcribed from this construct yielded infectious virus that was indistinguishable from the original virus isolate. The presumed Frankfurt-1 ancestor with an intact ORF 7b was reconstructed by using this novel reverse genetic system. In cell culture, the variant carrying the ORF 7b deletion had a slight replicative advantage compared to its presumed ancestory strain on certain cell lines. This effect was neither associated with changes in the induction or secretion of type I interferon, nor with altered induction of apoptosis in cell culture. However, pretreatment of cells with interferon beta caused the deleted virus to replicate to higher titers than the parental strain. In Syrian Golden Hamsters mean titers of infectious virus and viral RNA in the lungs after 24 h were increased with the deleted virus. This could explain earlier observations of enhanced virulence of Frankfurt-1 virus in Hamsters as compared to other SARS-Coronavirus reference strains and identifies the SARS-CoV 7b protein as an attenuating factor within the SARS-Coronavirus genome. Because attenuation was focused on the early phase of infection in-vivo, ORF 7b might have contributed to the delayed accumulation of virus in patients that was suggested to have limited the spread of the SARS epidemic.