Quantitative Bestimmung der relativen Telomeraseaktivität (RTA) in malignem Lebergewebe

Abstract

Das Ribonukleoprotein Telomerase vermag aufgrund seiner Fähigkeit zur reversen Transkription die chromosomale Stabilität von Zellen zu bewahren und hält somit ihre proliferative Kapazität aufrecht. Die Reaktivierung der Telomerase im Rahmen der Hepatokarzinogenese wurde bereits mehrfach nachgewiesen. Daher wurde die Nutzung der Aktivitätsmessung der Telomerase (TA) als Biomarker für das HCC von mehreren Autoren als Möglichkeit propagiert, die histopathologisch oft schwierige Diagnose des HCC und das Grading des Tumors zu erleichtern. In der klinischen Anwendung sind konventionelle PCR-basierte Methoden zur Messung von TA in Gewebeproben bislang nicht etabliert. Das liegt zum großen Teil an den oft erforderlichen aufwendigen und zeitintensiven post-PCR Analysen der Protokolle, die zusätzlich ein hohes Risiko an carry-over-Kontaminationen am Arbeitsplatz bergen. In dieser Arbeit wurde eine von Wege et al. entwickelte Methode zur Quantifizierung von TA weiterentwickelt, so dass mit wenig Aufwand eine zuverlässige Messung in Lebergewebeproben möglich ist. Mit diesem tRQ-TRAP wurde TA in insgesamt 18 menschlichen Lebergewebeproben quantifiziert: Normales Gewebe (n=6), Leberadenom (n=1), HCC (n= 9) und Lebermetastasen (n=2). Da die RNA-Untereinheit der Telomerase essentiell für die Enzymaktivität ist, wurde die RNA-Integrität mittels Gelanalyse überprüft. TA-positive 293T-Zellen dienten als Standards und Positivkontrollen in dem auf dem Fluorochrom SYBR Green basierenden PCR-Verfahren. Aus diesen Standards wurde die relative TA (RTA) pro μg Protein berechnet, inaktivierte Proben wurden als Negativkontrollen verwendet. Der Einfluss von möglichen PCR-Inhibitoren konnte gesondert durch Hinzufügen von TA-positiven Proben zu den Negativkontrollen ausgeschlossen werden. Geringe RTA zeigte sich erwartungsgemäß in normalem Lebergewebe (6,94±6,22), wobei Karzinomproben signifikant höhere Enzymaktivitäten aufwiesen (76,2±65,94, p=0,005). Tendenziell konnten höhere Werte für die RTA in G3-Tumoren (n=3) im Vergleich zu G2-Tumoren (n=5) beobachtet werden (111,8±57,88 vs. 41,4±62,32). Der Nachweis von TA wurde durch ein kommerziell erhältliches semiquantitatives Detektionskit bestätigt. Zusammenfassend ist tRQ-TRAP, bei Einhaltung der diskutierten Voraussetzungen bezüglich Qualität des Ausgangsmaterials, eine valide Methode zur TA-Quantifizierung aus Lebergewebeproben. Die Methode könnte grundsätzlich eine klinische Anwendung als unterstützendes Hilfsmittel bei der Diagnosefindung des HCC finden. Um hierfür Referenzbereiche zu definieren und Aussagen zur Sensitivität und Spezifität zu treffen, müsste zunächst an größere Kohorten von Proben gemessen werden.

Telomerase, a ribonucleoprotein with reverse transcriptase activity, enables human cells to maintain chromosome stability and to proliferate without limits. Various studies demonstrated telomerase reactivation in human hepatocellular carcinoma (HCC). Therefore, quantification of telomerase activity has been proposed to detect and classify HCC. However, up until now conventional PCR-based assays have demonstrated only limited applicability due to complex and time-consuming post-amplification procedures. In this study, a novel rapid closed-tube system, based on the telomeric repeat amplification protocol (TRAP), has been optimized and evaluated to quantitate telomerase activity in human liver tissue samples. Altogether, 18 liver tissue samples were obtained from the human tissue depository at our institution (6 normal liver, 1 liver adenoma, 9 HCC, and 2 liver metastases) and evaluated following confirmation of RNA integrity by gel analysis. The RNA subcomponent of the telomerase enzyme is essential for telomerase activity and thus crucial to allow valid quantification. For the real-time quantitative TRAP (tRQ-TRAP), telomerase-positive 293T cells were employed in a SYBR Green assay as standards to calculate the relative telomerase activity (RTA, mean±SEM) per μg of protein. RNAse- and heat-inactivated samples served as negative controls. Telomerase positive samples were added to heat-inactivated controls to rule out interference by PCR inhibitors. Low RTA levels were detected in normal liver (6,94±6,22) and liver adenoma, whereas HCC samples showed significantly higher levels(76,2±65,94, p=0,005). A tendency for higher RTA levels was observed in G3 (n=3) compared to G2 (n=5) tumors (111,8±57,88 vs. 41,4±62,32). Presence of telomerase activity was confirmed by a conventional polyacrylamid gel. In summary, tRQ-TRAP allows valid quantification of telomerase activity in liver tissue samples and might be employed to assess liver biopsies in patients with suspected HCC. For defining reference values, sensitivity, and specificity lareger series of tissue samples have to be evaluated.