Charakterisierung und Aufrechterhaltung der Amplifikation des Epidermalen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Gens in Zellkulturen aus dem humanen Glioblastoma Multiforme unter modifizierten Stammzell-Bedingungen

Abstract

In dieser Arbeit wurde versucht, frisches, aus chirurgischen Resektionen gewonnenes Tumormaterial aus primären Glioblastomen in eine serumfreie Zellkultur zu übernehmen, in der nach stabiler Langzeitexpansion der Kulturen sowohl der Nachweis von Hirntumorstammzellen gelingt, als auch die EGFR-Genamplifikation der Tumorzellen erhalten bleibt, was bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht gelungen war. Dabei wurden die Zellkulturen jeweils mit unterschiedlichen Mengen des Wachstumsfaktors EGF versorgt, sowie auch gänzlich ohne diesen expandiert. Es zeigte sich, daß das Wachstum der Zellen nicht mit der Zugabe von EGF korreliert ist, sondern vielmehr die mGS-Kulturen eines bestimmten Glioblastoms unabhängig von der Wachstumsfaktorzugabe durch ein bestimmtes Wachstumsmuster sowie ein eher beschleunigtes oder verzögertes Wachstum phänotypisiert sind. Insgesamt konnte dies durch eine Dichotomie in 2 Gruppen dargestellt werden, die sich in ihrer Proliferation deutlich unterschieden. Für einen sichtbaren Beginn der Proliferation brauchten die mGS-Kulturen ohne Zugabe von EGF jeweils deutlich mehr Zeit, als alle anderen Zellkulturen. Über den Untersuchungszeitraum veränderte sich darüberhinaus auch die Wachstumsmorphologie, so daß der anfängliche Unterschied zwischen adhärentem, semi-adhärentem und nicht adhärentem Wachstum sich am Ende der Kultivierungszeit zugunsten eines nahezu einheitlich nicht adhärenten Wachstumsmusters gewandelt hatte. Lediglich ⅓ der anfänglichen Kultivierungsversuche war über den langen Zeitraum erfolgreich, wobei nur zwei mGS-Kulturen aus einem einzigen Glioblastom ihre EGFR-Amplifikation aufrecht erhalten und sogar noch verstärkt hatten, namentlich GB-03/EGF(0) ohne Zusatz des Wachstumsfaktors EGF, hier hatte sich der Wert der Amplifikation sogar vervierfacht und GB-03/EGF(10), welche mit 10 ng/ml EGF kultiviert wurde, und eine Verdopplung des Ausgangswertes aufwies. Dabei ließ sich kein Zusammenhang zwischen einer Zugabe des Wachstumsfaktors EGF und einem Verlust der EGFR-Genamplifikation ersehen, was eine entsprechend seltene Mutations-Konstellation bei diesen beiden mGS-Kulturen aus GB-03 nahelegt. Methodisch zeigte sich die Analyse der Amplifikation mithilfe der Real-Time-PCR der konventionellen PCR überlegen, mit der auch eine quantitative Analyse der Zahl der Amplikons möglich wurde. Bei dieser Arbeit zeigten sich 23% der untersuchten Glioblastome als amplifiziert, geringfügig weniger, als in der Literatur beschrieben wird. Die nähere Untersuchung der mGS-Kulturen aus GB-03 bestätigte dann sowohl durch ihre kontinuierliche Proliferation als auch ihre relative Differenzierungsresistenz bei allen dieser drei Zellkulturen die vermutete Anwesenheit von Hirntumorstammzellen, wobei GB-03/EGF(5) sich in allen untersuchten Merkmalen von den beiden anderen Kulturen GB-03/EGF(0) und GB-03/EGF(10) ein wenig unterschied, am deutlichsten jedoch bei der Fähigkeit, einen Tumor in vivo zu generieren. In dem gewählten Mausmodell konnte nur GB-03/EGF(0) als tumorigen beurteilt werden, indem sie in allen Tieren einen das gesamte Hirngewebe diffus infiltrierenden Tumor ausbildete, ähnlich der Morphologie beim menschlichen Glioblastom. Eine recht starke bereits vor dem Differenzierungsversuch ausgeprägte oligodendrozytäre Vordifferenzierung könnte dabei ein Hinweis auf die Pathogenese dieses Tumors als sekundäres Glioblastom sein. Durch eine FISH-Analyse zeigte sich, daß die vorhandene EGFR-Genamplifikation einzelner Zellen als eher gleichmäßig zu beurteilen ist, und daß die quantitativen Unterschiede aus der Real-Time PCR-Messung wahrscheinlich eher aufgrund einer durch EGF-Zugabe mehr oder minder starken Population relativ gleichmäßig amplifizierter Zellen zustande kommt. Damit wurde erfreulicherweise das Ziel dieser Arbeit erreicht, und die nun vorhandene Langzeitkultur GB-03/EGF(0) eröffnet hoffentlich viele neue Möglichkeiten, wichtige Erkenntnisse über die Pathophysiologie des Epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors zu erlangen, dessen integriertes Signal eine solch überragende Bedeutung in der inter- und intrazellulären Kommunikation zu haben scheint.

In this thesis we tried to establish serum-free cell-cultures out of tissue from primary glioblastomas, which we get from neurosurgical resections, with the object to get cultures with cells who maintained their EGFR-gene-amplification and where we find evidence for the existence of so called tumorstemcells. We did that by using different concentrations of the growth-factor EGF and also by omitting this factor during cell-culture. It could be shown, that cell-proliferation was not correlated to the used EGF-concentration, and that all cultures grown out of one tumor had nearly the same growth-pattern, independent of EGF-addition and characterized by an either accelerated or delayed phenotype, so that we concluded a dichotomy in two groups with remarkable differences in their proliferation. Cell-cultures without addition of EGF needed more time to show an apparent proliferation. During the time of cell-culture the growth-pattern of the cells with semi-adherent growth changed to non-adherent growth, whereas the cells which showed the latter in the beginning retained that growth pattern. Only ⅓ of all tries to establish a cell-culture out of a tumor was successful, and only two mGS-cell-cultures maintained and also enhanced their EGFR-gene-amplification, namely GB-03/EGF(0) without any addition of EGF and with a quadruplicated value, and GB-03/EGF(10), cultured with a concentration of 10 ng/ml EGF, which doubled the original value of the amplification. Because there was no correlation between the used concentration of EGF and the loss of EGFR-gene-amplification we postulated a rare mutation in these mGS-cell-cultures from the tumor GB-03. The Real-Time PCR was methodically superior to the conventional PCR as we were able to do a quantitative analysis of the amplification. 23% of all analysed glioblastomas showed an EGFR-gene-amplification in the original tumor, a little bit less than described in the literature. Detailed studies of the mGS-cell-cultures of GB-03 showed continuous proliferation as well as resistance to differentiation, hereby confirming the postulated presence of braintumorstemcells. GB-03/EGF(5) showed differences to GB-03/EGF(0) and GB-03/EGF(10) in all researched features, most obviously in the ability to form a new tumor in vivo. In our mouse-model only GB-03/EGF(0) was able to form a tumor which showed a diffuse infiltrative growth pattern similar to that of human glioblastomas. A relatively strong oligodendrocytic pre-differentiation may be an indication for the pathogenesis as a secondary glioblastoma and FISH-analysis pointed out, that the value of the EGFR-gene-amplification in singular cells is nearly the same, and that the quantitative difference demonstrated by the Real-Time PCR could be explained by distinct strong populations of similar amplified cells in the mGS-cell-culture depending on the concentration of EGF. So the object was achieved, and we hope that this new long-term cell-culture GB-03/EGF(0) will help to do more research on the pathophysiology of the epidermal growth factor receptor whose integrative signal has such an outstanding relevance in the inter- and intracellular communication.