Detektion und Analyse zirkulierender Endothelzellen bei Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom

Abstract

In dieser Arbeit sollte die Anzahl zirkulierender Endothelzellen (CECs) im Verlauf der Therapie mit Sunitinib anhand eines Kollektivs von Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom untersucht werden. Ziel war es die Konzentration der CECs zu bestimmen und diese in Hinsicht auf Proliferationsverhalten und Apoptose näher zu analysieren. Für die Detektion wurde die bereits etablierte APAAP-Methode genutzt, mit der die Anzahl der zirkulierenden Endothelzellen bestimmt werden sollte. Zur Analyse des Funktionszustandes der CECs wurde eine Immunfluoreszenz-Doppelfärbung etabliert. Diese ermöglichte es, verschiedene Antikörper zu kombinieren und die Endothelzellen genauer zu charakterisieren. Es konnte beispielhaft anhand von HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) gezeigt werden, dass grundsätzlich eine Kombination des Endothelzellmarkers P1H12 mit dem Proliferationsmarker KI67 und dem Aktivierungsmarker CD106 in einer Immunfluoreszenz-Doppelfärbung möglich ist. Der P1H12-Antikörper konnte in der APAAP- und der Immunfluoreszenz-Färbung als geeigneter Endothelzellmarker bestätigt werden. Der KI67- Antikörper überzeugte in den Vorversuchen mit den HUVECs ebenso der CD106-Antikörper, insbesondere anhand von TNF-alpha vorbehandelten HUVECs. Somit können mithilfe der Immunfluoreszenz-Doppelfärbung zum einen CECs mit dem P1H12-Antikörper detektiert und zum anderen mit den Antikörpern KI67 und CD106 charakterisiert werden. Vorversuche mit dem Ziel, auch apoptotische CECs nachweisen zu können, in denen unter anderem hungernde HUVECs mit dem Caspase-3 Antikörper angefärbt wurden, blieben erfolglos. In weiteren Vorversuchen zeigte sich, dass die zirkulierenden Endothelzellen nur in sehr geringen Zahlen zu erwarten waren. Es wurden je 2.100.000 mononukleäre Zellen von acht unselektierten Tumorpatienten auf das Vorhandensein von CECs untersucht. Dabei konnten nur in vier von acht Patienten CECs nachgewiesen werden und bei diesen nur in sehr geringer Anzahl. Die 14 Nierenzellkarzinompatienten, die in der Sunitinib-Studie behandelt worden waren, waren in den APAAP-Färbungen durchweg negativ auf den P1H12-Antikörper. Somit ließen sich in dieser Patientengruppe mit dieser Methode keine CECs nachweisen. Diese negativen Ergebnisse ließen keine Durchführung der Immunfluoreszenz-Doppelfärbung bei den Studienpatienten zu. Grundsätzlich sind die zirkulierenden Endothelzellen als Surrogatmarker zum Einschätzen des Tumorstatus‘ und des Verlaufs einer eingeleiteten Therapie durchaus weiter zu untersuchen. Zudem sollte die Charakterisierung der CECs weiter vorangetrieben werden, um mehr über ihren Funktionszustand während des Tumorwachstums und einer Therapie in Erfahrung bringen zu können. Allerdings müssen dazu die Methoden weiter verfeinert und in ihrer Sensitivität und Reproduzierbarkeit weiterentwickelt werden.