Volltextdatei(en) vorhanden
Titel: Exploiting the thiamin biosynthesis of Staphylococcus aureus towards pro-drug discovery
Sonstige Titel: Nutzung der Thiamin-Biosynthese von Staphylococcus aureus zur Prodrug-Entwicklung
Sprache: Englisch
Autor*in: Drebes, Julia
Schlagwörter: Thiamin; MRSA; Staphylococcus aureus; thiamin; crystallography; pro-drug
GND-Schlagwörter: MRSA; Staphylococcus aureus; Vitamin B1; Kristallisation; Wirkstoff; Molekulardesign
Erscheinungsdatum: 2012
Tag der mündlichen Prüfung: 2012-11-02
Zusammenfassung: 
Vitamin B1 (thiamin) in its active form TPP is an important co-factor for a large variety of key enzymes in the carbohydrate and amino acid metabolism. Humans have to acquire this co-factor by dietary uptake, whereas most bacteria, fungi and plants are able to synthesise this co-factor de novo. Alarming statistics of fatal cases and resistance spread related to nosocomial infections with the pathogen Staphylococcus aureus require the identification of novel drug targets. In this context, the thiamin biosynthesis has been identified as a suitable target, as it is absent in humans and thus the risk of side effects is decreased and the potential drug could specifically poison the pathogen.
The genes of the six thiamin-synthesising enzymes were cloned and expressed successfully in E. coli. ThiM, TPK and TenA, were crystallised and the structure was solved applying synchrotron radiation. The oligomeric state observed in the crystal structure was confirmed in solution by small angle X-ray scattering (SAXS).
For drug discovery, the major focus was on the active site of ThiM, one of the first thiamin synthesising enzymes in this pathway. Bioinformatics tools were applied to identify the active site and the positioning of the substrate was verified by co-crystallisation experiments.
With the help of the active site architecture, substrate analogues were identified and analysed in terms of activity. Together with the binding epitopes for these compounds obtained by saturation transfer difference (STD)-NMR, a base for further optimisation was provided. Also the TPK structure could lead towards the discovery of an anti-staphylococcal drug.
Moreover, the relationship between the oligomeric state of TenA, an enzyme involved in thiamin salvage, and proteolytic stability were shown. Analysing the crystal structure of tetrameric TenA, interface residues were selected for site-directed mutagenesis to monomerise the wildtype (WT) protein. The mutant was successfully expressed and was compared to the WT protein in terms of activity, folding stability and protease stability. Regarding activity and folding stability, no major differences have been observed, whereas the WT protein was significantly more stable against digestion with serine proteases. This would suggest that S. aureus might be able to protect TenA from intracellular proteases and proteases secreted during infection through stabilising oligomerisation of the protein.

Vitamin B1 (Thiamin) in seiner aktiven Form TPP ist ein wichtiger Co-Faktor für viele Schlüsselenzyme des Kohlenhydrat- und Aminosäurestoffwechsels. Menschen sind darauf angewiesen ihren Bedarf über die Nahrung zu decken, wohingegen die meisten Bakterien, Pilze und Pflanzen in der Lage sind Thiamin de novo zu synthetisieren. Alarmierende Todesstatistiken und die zunehmende Verbreitung von Resistenzen im Zusammenhang mit nosokomialen Infektionen durch das Bakterium Staphylococcus aureus erfordern die Identifikation und Analyse neuartiger Angriffsziele für Antibiotika. In diesem Zusammenhang wurde die Vitamin B1 Biosynthese als geeignetes Ziel ermittelt, da sie im Menschen nicht existiert und dadurch unerwünschte Nebenwirkungen ausgeschlossen werden können, indem der Wirkstoff spezifisch den Krankheitserreger angreift.
Die Gene der sechs thiamin-synthetisierenden Enzyme konnten kloniert und erfolgreich in E. coli exprimiert werden. Die Enzyme ThiM, TPK und TenA wurden kristallisiert und die Struktur dieser Proteine konnte durch die Bestrahlung der Kristalle mit Synchrotronstrahlung gelöst werden. Der in der Kristallstruktur bestimmte Oligomerisierungsgrad wurde für diese Proteine mittels Röntgenkleinwinkelbeugung (SAXS) auch in Lösung bestätigt.
Für die Wirkstoffentwicklung lag der Schwerpunkt auf dem aktiven Zentrum von ThiM, eines der ersten Enzyme, die am Aufbau von Thiamin beteiligt sind. Mittels bioinformatischer Methoden wurde das aktive Zentrum lokalisiert und die Positionierung des Substrats konnte durch eine Co-Kristallstruktur bestätigt werden.
Auf Basis der Architektur des aktiven Zentrums wurden Substratanaloga identifiziert und hinsichtlich ihrer Aktivität analysiert. Zusammen mit den Bindungsepitopen, die durch Saturation Transfer Difference (STD)-NMR bestimmt wurden, konnte die Grundlage für die weitere Optimierung dieser Komponenten geschaffen werden. Auch die Einbeziehung der Kristallstruktur von TPK in den Optimierungsprozess könnte in Zukunft zur Entwicklung eines Wirkstoffs gegen Staphylokokken führen.
Darüber hinaus wurde der Zusammenhang zwischen dem Oligomerisierungsgrad von TenA, einem Thiamin-spaltendem Enzym und der Proteasestabilität dieses Enzyms gezeigt. Durch die Untersuchung der Kristallstruktur von tetramerem Wildtyp-TenA wurden Aminosäuren in den Grenzflächen des Tetramers ausgewählt und mittels ortsgerichteter Mutagenese gegen andere Aminosäuren ausgetauscht, die zur Bildung eines Monomers führten. Das mutierte Gen wurde erfolgreich exprimiert und in Hinblick auf Aktivität, Stabilität der Faltung und Proteasestabilität mit dem Wildtypprotein verglichen. Bezüglich der Aktivität und der Stabilität der Proteinfaltung konnten keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante festgestellt werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass das Wildtypprotein eine deutlich erhöhte Stabilität gegenüber dem Verdau mit Serinproteasen aufwies. Das deutet darauf hin, dass S. aureus seine Proteine vor intrazellulären Proteasen und solchen Proteasen, die während der Infektion sekretiert werden durch den Aufbau von Oligomeren schützen könnte
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/4721
URN: urn:nbn:de:gbv:18-59613
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

Dateien zu dieser Ressource:
Datei Beschreibung GrößeFormat  
Dissertation.pdf8.34 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen
Zur Langanzeige

Diese Publikation steht in elektronischer Form im Internet bereit und kann gelesen werden. Über den freien Zugang hinaus wurden durch die Urheberin / den Urheber keine weiteren Rechte eingeräumt. Nutzungshandlungen (wie zum Beispiel der Download, das Bearbeiten, das Weiterverbreiten) sind daher nur im Rahmen der gesetzlichen Erlaubnisse des Urheberrechtsgesetzes (UrhG) erlaubt. Dies gilt für die Publikation sowie für ihre einzelnen Bestandteile, soweit nichts Anderes ausgewiesen ist.

Info

Seitenansichten

98
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 13.04.2021

Download(s)

8
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 13.04.2021
Werkzeuge

Google ScholarTM

Prüfe