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Titel: SUMO-modification of the RNA-binding protein La enhances its binding to the translational start site of cyclin D1
Sonstige Titel: SUMO-Modifizierung des RNA-Bindungsprotein La steigert dessen Bindung zur Translationsstartstelle von Zyklin D1
Sprache: Englisch
Autor*in: Kühnert, Julia
Schlagwörter: La Protein; Zyklin D1; Sumoylierung; CCND1; RNA-Bindung; La protein; cyclin D1; CCND1; RNA-binding; sumoylation
Erscheinungsdatum: 2012
Tag der mündlichen Prüfung: 2012-09-28
Zusammenfassung: 
Das essentielle, humane La Protein (hLa) stimuliert die interne ribosomale Eintrittstelle (IRES, engl. internal ribosomal entry site) -Element vermittelte Translation viraler und zellulärer mRNAs. Die IRES-vermittelte Translation ermöglicht der kleinen Ribosomenuntereinheit eine direkte Bindung an den 5’-nichttranslatierten Bereich (5’-UTR, engl. untranslated region) bestimmter mRNAs. Die Aktivierung dieses Translationsmechanismusses findet vor allem unter Zellstress und in Krebszellen statt, wenn die 5’-Cap-abhängige Translation beeinträchtigt ist. IRES-transaktivierende Faktoren (ITAFs) werden oft für diese Translationsform benötigt. Humanes La wurde als erster zellulärer ITAF identifiziert und stimuliert die IRES-Translation des Zellzyklus regulierenden und kooperativen Onkogens cyclin D1 (CCND1) in HeLa-Zellen. Das hLa-Protein ist in verschiedenen Krebsarten überexprimiert und wird durch SUMO (small ubiquitin like modifier) posttranslationell modifiziert. Die genannten Erkenntnisse unterstützen die Hypothese, dass das hLa Protein mit dem CCND1-IRES-Element interagiert und diese Interaktion durch SUMO-Modifizierung reguliert wird. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Experimente zur Identifizierung sowohl der Bindungsstelle des La Proteins in der 5’-UTR der CCND1 mRNA als auch der erforderlichen Bindungs-domänen. Zusätzlich wurden Untersuchungen zur Modulation der RNA-Bindungsaktivität des hLa-Proteins durch SUMO-Modifikation durchgeführt.
In dieser Studie wurde gezeigt, dass das hLa-Protein an oder in der Nähe der CCND1 Translationstartstelle bindet. RNA-Bindungsstudien ergaben, dass sowohl das RNA-Erkennungsmotiv 1 (RRM1) als auch RRM2 für die Vermittlung der CCND1 RNA-Bindung verantwortlich sind. Basische und aromatische Aminosäuren im C’-Terminus des La Proteins beeinflussen vermutlich die RNA-Bindungsaktivität negativ. Anhand eines etablierten in vitro-Sumoylierungsprotokolls für hLa wurden die Lysine 200 und 208 als Modifikationsstellen identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass die RNA-Bindungsaktivität von hLa durch SUMO-Modifizierung gesteigert wird.
Die molekularen Erkenntnisse dieser Studie ermöglichen zukünftige Experimente zur Untersuchung der La-stimulierten IRES-vermittelten Translation. Des Weiteren kann die Modifizierung von hLa durch SUMO als potentieller neuer Mechanismus zur Regulation der aberranten CCND1-Expression in SUMO-La-überexprimierten Zellen untersucht werden.

The essential RNA-binding protein La is implicated in stimulating internal ribosome entry site (IRES)-mediated translation of cellular mRNAs. This type of translation enables the small ribosomal subunit (40S) to directly bind to the 5’-untranslated region (5’-UTR) of certain mRNAs. This mechanism is often activated in stressed and cancerous cells when cap-dependent translation is compromised. IRES trans-acting factors (ITAFs) have been shown to facilitate IRES-mediated translation. The human La (hLa) protein was the first cellular ITAF described and is known to stimulate the IRES-mediated translation of cell cycle progression regulator and cooperative oncogene cyclin D1 (CCND1) in HeLa cells. The hLa protein is overexpressed in various kinds of cancer, and is posttranslational modified by the small ubiquitin like modifier (SUMO). These findings support the hypothesis that the hLa protein interacts with the CCND1 IRES and may be regulated by SUMO-modification. To test this hypothesis experiments where designed to map the hLa binding site within the 5’-UTR of CCND1 mRNA, to identify minimal hLa domains required for binding, and to demonstrate that SUMO-modification modulates the RNA-binding activity of hLa.
Herein, it is shown that the hLa protein binds at or in close proximity to the translational start site of CCND1. The binding affinities for a number of La mutants were determined by electrophoretic mobility shift assays and fluorescence polarization, leading to the conclusion that both RRM1 and RRM2 of hLa are required for binding and that basic amino acids located in the C’-terminus have a negative effect on the RNA-binding activity. An in vitro sumoylation protocol for hLa was established, and utilized in identifying of lysine 200 and 208, which are located between RRM1 and RRM2, as SUMO-acceptor sites of hLa. The RNA-binding activity of hLa was enhanced upon SUMO-modification.
In conclusion, this study provides the molecular knowledge to aid future experiments into whether RRM1-RRM2-mediated binding of hLa to the CCND1 translational start site is critical for stimulating translational initiation. More importantly, it will aid in the investigation whether SUMO-modification of hLa is a novel mechanism by which the expression of the cooperative oncogene CCND1 is aberrantly regulated in cells overexpressing hLa.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/4734
URN: urn:nbn:de:gbv:18-59753
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Dobner, Thomas (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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