Biochemical and Structural Characterization Of Three Thermostable and Metagenome-Derived Lipolytic Enzymes

Abstract

Carboxylesterases (EC 3.1.1.1) and triacylglycerol lipases (EC 3.1.1.3) are lipolytic enzymes acting on ester bonds and catalyze both hydrolysis and synthesis reactions on a broad spectrum of substrates. Industrial production processes sometimes demand high working temperatures and thus customized biocatalysts showing high thermostability. Still, most lipases used today originate from mesophilic organisms and are susceptible to heat denaturation. Within this thesis, the identification and detailed characterization of two novel thermostable lipases and one carboxylesterase are described. Two different long-term enrichment cultures that were either inoculated with heating water from the Biocenter Klein Flottbek (Hamburg, Germany) or soil and water samples from the nearby Botanical Garden were maintained at 75 and 65°C for 3 weeks. Microbial communities were characterized on a phylogenetic level and prevalently contained organisms related to Thermus scotoductus (up to 100% of the culture) and Symbiobacterium thermophilum (approx. 80% of the culture). From the genomic DNA, metagenomic libraries were constructed using E. coli Epi100 as host bacterium. Functional screening of these libraries using tributyrin and pNP-substrates (C4 and C12) between 50 and 70°C resulted in the identification of 10 lipolytic clones. Two of them that showed higher activity in previous tests have been studied in detail and the respective lipases were designated LipS and LipT. From six other metagenomes constructed within the working group, altogether over 100 clones with lipolytic activity were screened. The esterase Est5E5 was found by tributyrin-screening together with six other lipolytic clones within the metagenomic library of a biofilm growing on the valve of a fresh water pipeline, but only Est5E5 was further characterized. LipS was identical in its amino acid sequence to an annotated esterase from Symbiobacterium thermophilum IAM14863 and LipT had 96% identity to a putative esterase from Thermus scotoductus SA-01, whereas Est5E5 showed 84% identity to a conserved hypothetical protein from Acidovorax radicis N35. None of these three enzymes could be grouped into any of the eight described lipase and esterase families with current alignment methods. Thus, they may constitute members of new families. After overexpression in E. coli BL21 (DE3) and subsequent His6-tag purification, the recombinant LipS (32 kDa) revealed very high thermostability with 50% residual activity after 48 h incubation at 70°C while LipT (38 kDa) possessed 50% residual activity after 3 h at this temperature. Est5E5 (50 kDa) was less heat-stable and retained 50% activity after 40 min at 50°C. With temperature optima at 70°C (LipS), 75°C (LipT) and 50°C (Est5E5), all three enzymes had thermophilic properties. Besides, they were stable against most solvents, detergents and inhibitors tested and were most active between pH 8.0 and 8.6. LipS and Est5E5 showed the highest specific activity for pNP octanoate (C8, 12.0 and 7.7 U/mg, respectively) and LipT for pNP decanoate (C10, 0.6 U/mg). In contrast to Est5E5, LipS and LipT also showed activity on pNP palmitate (C16) and stearate (C18). Furthermore, the three enzymes acted on pharmaceutically relevant chiral substrates like naproxen and ibuprofen esters. LipS was highly (R)-specific for ibuprofen phenyl ester with an enantiomeric excess (ee) of over 99% as well as for acetates of secondary alcohols (1-phenyl-2-butylacetate and 1-phenyl-2-pentylacetate) with an ee of more than 96%. Interestingly, LipS was able to synthesize the esters 1-propyl laurate and 1-tetradecyl myristate at 70°C under non-aqueous conditions in comparable rates to the commercial Candida antarctica lipase B. The structure of LipS was solved by X-ray crystallographic analyses with a resolution of 1.99 Å and the crystal revealed an unusual and compact lid-structure in a closed conformation. Furthermore, Pseudomonas antarctica Shivaji CMS35 was used to improve the low-temperature expression of the above mentioned lipase LipT. For this purpose, the genome was sequenced and analyzed. The psychrophilic bacterium exhibited characteristics suitable for serving as heterologous host (e. g. sensitivity against common antibiotics, secretion systems type I-III, Vb, VI, Sec and Tat) and showed promising results in comparison with IPTG-induced E. coli BL21 (DE3) concerning enzyme yield (E. coli: 3.01 mg/g of cell pellet, P. antarctica: 1.15 mg/g) and activity of LipT (E. coli: 0.12 U/mg, P. antarctica: 0.39 U/mg).

Carboxylesterasen (EC 3.1.1.1) und Triacylglycerol-Lipasen (EC 3.1.1.3) sind lipolytische Enzyme, die sowohl Hydrolyse- als auch Synthese-Reaktionen an Esterbindungen von einer Vielzahl an Substraten katalysieren können. Industrielle Produktionsprozesse benötigen oft hohe Reaktionstemperaturen und daher passende Biokatalysatoren mit hoher Thermostabilität. Dennoch stammen die meisten der heute genutzten Lipasen aus mesophilen Organismen und sind anfällig für Hitzedenaturierung. In dieser Arbeit wurden zwei neuartige thermostabile Lipasen sowie eine Esterase identifiziert und im Detail charakterisiert. Zwei verschiedene Anreicherungskulturen wurden zum einen mit einer Heizungswasserprobe aus dem Biozentrum Klein Flottbek (Hamburg, Deutschland) und zum anderen mit Boden- und Wasserproben aus dem benachbarten Botanischen Garten inokuliert und bei 75 bzw. 65°C für drei Wochen inkubiert. Die mikrobiellen Gemeinschaften wurden phylogenetisch charakterisiert und enthielten vornehmlich Organismen in enger Verwandtschaft zu Thermus scotoductus (bis zu 100% der Kultur) und Symbiobacterium thermophilum (ca. 80% der Kultur). Mit der genomischen DNA wurden anschließend Metagenom-Bibliotheken in E. coli Epi100 als Wirtsbakterium konstruiert. Durch deren funktionsbasierte Durchmusterung auf Tributyrin und mit pNP-Substraten (C4 und C12) bei 50 bis 70°C konnten zehn lipolytische Klone identifiziert werden. Zwei dieser Klone, die in vorangegangenen Tests höhere Aktivität zeigten, wurden weiter untersucht und die jeweiligen Lipasen als LipS und LipT bezeichnet. In sechs anderen Metagenomen, die innerhalb der Arbeitsgruppe konstruiert worden waren, wurden insgesamt über 100 Klone mit lipolytischer Aktivität gefunden. Die Esterase Est5E5 wurde zusammen mit sechs anderen lipolytisch-aktiven Klonen bei der Durchmusterung auf Tributyrin in der Metagenom-Bibliothek eines Biofilms gefunden, der sich auf dem Absperrschieber einer Trinkwasserleitung befand, es wurde jedoch nur Est5E5 genauer charakterisiert. LipS war auf Aminosäure-Ebene identisch mit einer annotierten Esterase von Symbiobacterium thermophilum IAM14863 und LipT besaß 96% Identität zu einer putativen Esterase von Thermus scotoductus SA-01, wohingegen Est5E5 zu 84% identisch mit einem konservierten hypothetischen Protein von Acidovorax radicis N35 war. Keines dieser drei Enzyme konnte mit gängigen Abgleichungsmethoden einer der acht beschriebenen Lipase- und Esterase-Familien zugeordnet werden. Sie könnten daher Mitglieder neuer Familien darstellen. Nach Überexpression in E. coli BL21 (DE3) und anschließender His6-tag Aufreinigung zeigte das rekombinante LipS (32 kDa) sehr hohe Thermostabilität mit 50% Restaktivität nach 48 Std. Inkubation bei 70°C, während LipT (38 kDa) bei dieser Temperatur nach 3 Std. 50% Restaktivität beibehielt. Est5E5 (50 kDa) war weniger hitzestabil und besaß nach 40 Min. bei 50°C 50% Restaktivität. Mit Temperaturoptima von 70°C (LipS), 75°C (LipT) und 50°C (Est5E5) zeigten alle drei Enzyme thermophile Eigenschaften. Zusätzlich waren sie gegen die meisten der getesteten Lösungsmittel, Detergentien und Inhibitoren stabil und waren im Bereich von pH 8.0 bis 8.6 am aktivsten. LipS und Est5E5 zeigten die höchste spezifische Aktivität für pNP-Octanoat (C8; 12,0 bzw. 7,7 U/mg) und LipT für pNP-Decanoat (C10; 0,6 U/mg). Im Gegensatz zu Est5E5 konnten LipS und LipT auch pNP-Palmitat (C16) und -Stearat (C18) umsetzen. Die drei Enzyme waren auch auf pharmazeutisch relevanten chiralen Substraten wie Naproxen und Ibuprofen aktiv. LipS besaß hohe (R)-Spezifität auf Ibuprofen-Phenylester mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von über 99% und auf Acetaten sekundärer Alkohole (1-Pheny-2-butylacetat und 1-Phenyl-2-pentylacetat) mit einem ee von über 96%. Interessanterweise war LipS in der Lage, die Ester 1-Propyllaurat und 1-Tetradecylmyristat bei 70°C unter nichtwässrigen Bedingungen in vergleichbaren Raten wie die kommerzielle Candida antarctica Lipase B zu synthetisieren. Die Struktur von LipS wurde mit Röntgenkristall-Strukturanalysen zu einer Auflösung von 1,99 Å aufgeklärt und offenbarte eine ungewöhnliche und kompakte Lid-Struktur, die sich in einer geschlossenen Konformation befand. Weiterhin wurde Pseudomonas antarctica Shivaji CMS35 verwendet, um die Expression der bereits erwähnten Lipase LipT bei niedriger Temperatur zu verbessern. Für diesen Zweck wurde das Genom sequenziert und analysiert. Das psychrophile Bakterium wies passende Charakteristika auf, um als heterologer Wirt zu dienen (u. a. Sensitivität gegenüber häufig genutzten Antibiotika, Sekretionssysteme Typ I-III, Vb, VI, Sec und Tat) und brachte vielversprechende Ergebnisse im Vergleich zu IPTG-induziertem E. coli BL21 (DE3) bezüglich Enzymausbeute (E. coli: 3,01 mg/g Zellpellet; P. antarctica: 1,15 mg/g) und Aktivität von LipT (E. coli: 0,12 U/mg; P. antarctica: 0,39 U/mg).