Exploring the functions of a Kaposi´s sarcoma-associated herpesvirus-encoded microRNA in vitro and in vivo

Abstract

Kaposi´s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), a human lymphotropic gamma-herpesvirus, is etiologically linked to Kaposi's sarcoma (KS) and to two B-cell lymphoproliferative diseases: primary effusion lymphoma (PEL) and multicentric Castleman's disease (MCD). Because the majority of tumor cells in these malignancies are latently infected, latent genes are thought to play an important role in virus-induced tumorigenesis. In this regard, the KSHV-encoded microRNA (miRNA) miR-K12-11 has garnered considerable interest. miRNAs are ~ 21 - 24 - nucleotide long RNAs that post-transcriptionally repress gene expression. It is commonly accepted that a perfect binding of the so-called seed region of the miRNA (2 - 8 nt from the 5′ -end) to the 3'-UTR of the target mRNA is crucial for miRNA-mediated repression. miR-K12-11 is constitutively expressed in cell lines derived from KSHV-associated tumors and shares perfect seed homology to the human hsa-miR-155, an oncomiR which is overexpressed in numerous human cancers. Thus, it seems likely that mimicry of miR-155 by miR-K12-11 may contribute to cellular transformation in KSHV-associated disease. Since miR-155 functions in B-cell development and differentiation as well as germinal center formation, one advantage the virus might gain by this mimicry is the ability to modulate B-cell responses. To explore miRNA functions and mimicry in vivo, retroviral-mediated gene transfer combined with bone marrow transplantation in C57BL/6 mice was performed such that mouse recipients constitutively expressed miR-K12-11 or human (hsa-) miR-155 in hematopoietic progenitor cells (HPCs). Phenotypic alterations associated with constitutive expression of either hsa-miR-155 or viral miR-K12-11 were investigated side-by-side. We observed that retroviral-mediated gene transfer and subsequent bone marrow transplantation led to increased B-cell fractions in lymphoid organs, as well as enhanced germinal center formations in spleen in both miRNA mouse cohorts. Additionally, Jarid2, a component of Polycomb repressive complex 2, was validated as a novel target of miR-K12-11 using luciferase reporter assay and western blot analysis. The downregulation of this gene was furthermore confirmed in miR-K12-11 as well as hsa-miR-155 expressing bone marrow cells. Interestingly, previous studies have suggested that repression of Jarid2 might contribute to increased B-cell survival. These findings underscore the notion that miR-K12-11 may have evolved to mimic hsa-miR-155 functions in KSHV-infected B-cells. The expression of miR-K12-11 may represent one mechanism by which KSHV reprograms naïve B-cells toward long-living memory B-cells, but which at the same time may pre-dispose infected lymphocytes to malignant transformation.

Das humanpathogene Kaposi Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist das ätiologische Agens des Kaposi Sarkoms sowie des primären Effusionslymphoms und wird darüber hinaus mit der Pathogenese bestimmter Formen der multizentrischen Castleman Krankheit in Verbindung gebracht. Die genaue Rolle des KSHV während der Ätiogenese dieser Tumore ist noch ungewiss. Aufgrund der Tatsache, dass KSHV-positive Tumorzellen latent infiziert sind, scheinen jedoch Latenzgene eine bedeutende Rolle zu spielen. Während der Latenz werden neben einigen wenigen Proteinen insgesamt 12 virale microRNA (miRNA) Gene exprimiert. Besondere Aufmerksamkeit gilt in diesem Kontext der KSHV-kodierten miR-K12-11. miRNAs sind kleine (~ 21 - 24 nt), nicht-kodierende RNA-Moleküle, die post-transkriptionell die Genexpression regulieren. Es wird vermutet, dass die kurze seed-Sequenz der miRNA (2 - 8 nt ausgehend von dem 5´-Ende) wichtig für die Bindung an die 3´-UTR der Ziel-mRNA ist. In diesem Sinne ist die miR-K12-11 interessant, da sie eine 100-%ige Übereinstimmung der zellulären miR-155 in der seed-Sequenz aufweist, was eine Mimikry vermuten lässt. Für das Virus erscheint diese funktionelle Analogie bedeutsam, da wichtige Funktionen der miR-155 in der B-Zell Antwort und der Aktivierung von Keimzentren liegen. Darüber hinaus ist die als oncomiR klassifizierte miR-155 in einer Vielzahl von Krebsarten überexprimiert. Es wird daher vermutet, dass die miR-K12-11 Expression auch in die KSHV-induzierte Tumorgenese involviert ist. Diese Annahme wird durch die Beobachtung der konstitutiven miR-K12-11 Expression in KSHV-assoziierten Tumorzelllinien gestützt. Zur Untersuchung der Funktion der miR-K12-11 in vivo wurde ein retroviral-vermittelter Gen-Austausch mit anschließender Knochenmarkstransplantation in C57BL/6 Mäusen durchgeführt, so dass in Empfängermäusen die transplantierten hämatopoetischen Vorläuferzellen miR-K12-11 oder humane (hsa-) miR-155 konstitutiv exprimierten. Auf diese Weise konnte die Auswirkung der miR-K12-11 und hsa-miR-155 Expression direkt in vivo verglichen werden. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression sowohl der humanen als auch der viralen miRNA in transplantierten hämatopoetischen Vorläuferzellen zum vermehrten Auftreten von B-Zellen in den lymphatischen Organen der Empfängermäuse führte. Darüber hinaus wurde die verstärkte Bildung von Keimzentren in der Milz beobachtet. Diese Beobachtung gleicher Phänotypen innerhalb beider miRNA Maus Kohorten deutet eine Mimikry an. Des Weiteren wurde Jarid2, eine Komponente des Polycomb repressive complex 2, als neues Ziel-Gen für miR-K12-11 mittels eines Luciferase Reporter Assays und einer Western Blot Analyse erfolgreich validiert. Zusätzlich wurden geringere Jarid2 Expressionslevel in isolierten miRNA-exprimierenden Knochenmarkszellen im Vergleich zu Kontrollzellen detektiert. Erwähnenswert ist hierbei, dass eine reprimierte Jarid2 Expression in B-Zellen vermutlich das Überleben der Zelle fördert. Insgesamt bestärken die erzielten Daten die Hypothese, dass miR-K12-11 die Funktion der zellulären miR-155 nachahmt. Die Expression der miR-K12-11 repräsentiert somit einen potentiellen Mechanismus, der zur Induktion der Differenzierung von infizierten naiven B-Zellen in B-Gedächtniszellen sowie zum Überleben der Zelle beitragen könnte. Dies würde zum einen dem Virus ermöglichen, lebenslang im Wirt zu persistieren, und könnte zum anderen die infizierte Zelle für eine maligne Transformation prädisponieren.