RGB-Markierung : Eine neue Methode für die Analyse zellulärer Klone in vitro und in vivo

Abstract

Fluoreszenzproteine haben sich in vielen biowissenschaftlichen Anwendungen als effektives Mittel zur Markierung von Zellen bewährt. Mit keinem anderen Marker ist eine derartig schnelle und eindeutige Identifizierung markierter Zellen möglich. Auf Grund einer limitierten Anzahl verfügbarer Fluoreszenzproteine ist eine individuelle Markierung einzelner Zellen mit vielen unterschiedlichen Farben und eine damit verbundene Unterscheidung und Verfolgung einzelner Zellklone innerhalb eines Zellverbandes jedoch nur beschränkt möglich. In der vorliegenden Dissertation wurde - basierend auf der Dreifarbentheorie - eine neue Methode der fluoreszenzbasierten Zellmarkierung etabliert: die RGB-Markierung. Bei der Methode wurden drei lentivirale Vektoren verwendet, die jeweils ein rotes (mCherry), ein grün-gelbes (Venus) und ein blaues (Cerulean) Fluoreszenzprotein als Transgen exprimieren (RGB-Vektoren). Mit dem Ziel der RGB-Markierung werden die RGB-Vektoren gleichzeitig auf Zielzellen gegeben, wodurch die Vektoren zufällig in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen in das Genom einer Zelle integrieren. Die Expressionshöhe der einzelnen Fluoreszenzfarben wird dabei sowohl von der Kopienzahl als auch den jeweiligen Integrationsorten beeinflusst. In der Summe werden in den RGB-markierten Zellen unterschiedliche Mengen der drei Fluoreszenzproteine exprimiert, wodurch in der Addition - analog zur Dreifarbentheorie - eine Vielzahl neuer Fluoreszenzfarben (Mischfarben) in den einzelnen Zellen generiert wird. Da die lentiviralen RGB-Vektoren stabil in das Genom der Zellen integrieren, wird das individuelle Expressionsmuster der drei Fluoreszenzproteine auch an alle Tochterzellen weitergegeben. Alle Zellen, die aus einer einzelnen transduzierten Zelle entstanden sind, können daher anhand ihrer spezifischen (individuellen) Fluoreszenzfarbe identifiziert werden. Die RGB-Markierung ist also nicht nur eine neue Methode der fluoreszenzbasierten Zellmarkierung, sondern darüber hinaus auch eine neuartige Methode zur Verfolgung und Identifikation von Zellklonen. In der vorliegenden Arbeit wurde die RGB-Markierung zur Verfolgung von Zellklonen in der Leber verwendet: In uPA/SCID-Mäusen konnte die klonale Zusammensetzung der Regeneration einer geschädigten Leber durch transplantierte Leberzellen visualisiert und anhand dessen beurteilt werden. Zudem konnte mit der neuen Methode das klonale Wachstum von Tumoren in der Leber verfolgt werden. Die Klonalität der RGB-Markierung wurde sowohl zell- als auch molekularbiologisch bestätigt. Auch die Stabilität der RGB-Markierung über lange Zeiträume und multiple Zellteilungen konnte sowohl in vitro als auch in vivo (u.a. durch serielle Transplantationen) nachgewiesen werden.