Identifizierung und molekulare Charakterisierung neuer CLIM und RLIM interagierender Proteine aus Mus musculus

Abstract

Die Familie der LIM-Proteine ist eine große und sehr diverse zytoplasmatische und nukleäre Gruppe von Proteinen, deren gemeinsames Merkmal eine oder mehrere LIM-Domänen darstellen. LIM-Proteine sind beteiligt an der Ausbildung von Zellidentität, Zelldifferenzierung und der Kontrolle von Zellwachstum. Allen gemeinsam ist die LIM-Domäne, eine Doppel-Zink-finger Struktur die für Protein-Protein Interaktionen von Bedeutung ist. LIM-Proteine sind an der Formation von Multiprotein-Komplexen beteiligt. Nukleäre Vertreter der LIM-Proteine sind die LIM-Homöodomänen (LIM-HD) Transkriptionsfaktoren und deren Kofaktor Familien, die CLIM-Proteine und LIM-only (LMO) Proteine. Hierbei modulieren CLIM-Proteine als Adaptoren, mittels Interaktion und Ausbildung eines tetrameren Protein-Komplexes mit LIM-HD Proteinen, die Genexpression. Hierbei wird vor allem die Organogenese und Entwicklung bestimmter Hirn-Strukturen gesteuert. Die Regulation der Transkription ist ein hoch komplexer Prozess, bei dem viele Proteine am Zielgenpromotor koordiniert wechselwirken. Um ein Gleichgewicht dieser Multiprotein-Komplexe zu erreichen, werden die Konzentrationen von entscheidenden Proteinen durch Ubiquitin-abhängige proteasomale Degradation kontrolliert. Das Ubiquitin Proteasom System ist für eine zeitlich koordinierte Degradation von kovalent Ubiquitin-markierten Ziel-Proteinen verantwortlich. Als ein großer Protein-Komplex erkennt und prozessiert das 26S-Proteasom Polyubiquitin-markierte Proteine zu Peptiden und kleineren Fragmenten. Die selektive Ubiquitinierung von Ziel-Proteinen wird durch Ubiquitin-Ligasen vermittelt. Die Ubiquitin-Ligase RLIM markiert CLIM-Proteine zum Abbau und reguliert durch dessen Proteolyse die Expression von Zielgenen der LIM-HD Proteine. Als Kofaktoren der Transkription, spielen CLIM-Proteine eine entscheidende Rolle für die Aktivität der LIM-HD Transkriptionsfaktoren. Viele weitere Transkriptionsfaktoren werden ebenfalls proteasomal reguliert. Der hormonabhängige Transkriptionsfaktor Östrogen-Rezeptor alpha (ERalpha) wird nach Ligandenbindung und Genaktiverung proteasomal degradiert. Erst die Rekrutierung des 26S-Proteasoms führt zu einer ordnungsmäßig durchgeführten Expression von ERalpha Zielgenen. Im Rahmen meiner Doktorarbeit sollten vorerst neue Interaktionspartner von CLIM-Proteinen näher analysiert werden. Es sollten vor allem molekulare Mechanismen der Assemblierung und Dynamik von LIM-HD-Multiprotein-Komplexen aufgeklärt werden. Weiterhin sollte ein direkter Einfluss der Formation von Multiprotein-Komplexen auf die Regulation der Genexpression untersucht werden. Es stellte sich heraus, dass die Rekrutierung von SSDP1 (single strand DNA binding protein 1) zu LIM-HD-Zielgenpromotoren, einen wichtigen Einfluss auf die Genexpression hat. Über direkte Interaktion mit CLIM-Proteinen, moduliert SSDP1 die Stabilität des gesamten LIM-HD-CLIM-SSDP1-Komplexes, mittels Protektion von CLIM- und LIM-HD-Proteinen vor proteasomalem Abbau durch das 26S-Proteasom. Es konnte aufgezeigt werden, dass das Proteasom koordiniert in die Genexpression von LIM-HD-Transkriptionsfaktoren entscheidend eingreift. In einem weiteren Projekt sollte eingehend analysiert werden, ob die Ubiquitin-Ligase RLIM und CLIM2-Kofaktor Proteine in ERalpha vermittelter Transkription in Brustkrebszellen, involviert sind. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl RLIM als auch CLIM2-Proteine eine neue Gruppe von Kofaktoren in der Regulation der Expression von ERalpha Zielgenen darstellen. Hierbei konnte das CLIM2-Protein als Korepressor und RLIM als Koaktivator der Transkription identifiziert werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass CLIM2 und RLIM mit ERalpha interagieren und die Transkription individuell modulieren. Durch den Einsatz eines Tissue-Microarrays (TMA) mit einem Patientenkollektiv von ca. 1400 Brustkrebspatientinnen, wurde ein möglicher Zusammenhang der ERalpha-Expression, als ein prognostischer Marker für Brustkrebs, mit der Expression von CLIM2-Proteinen untersucht.