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Titel: Untersuchungen zur Funktion des PI3K/Akt-Signalweges für das Wachstum von disseminierten Tumorzelllinien von Patienten mit Malignomen
Sprache: Deutsch
Autor*in: Grupp, Katharina
Erscheinungsdatum: 2011
Tag der mündlichen Prüfung: 2011-11-02
Zusammenfassung: 
Die Dissemination von einzelnen Tumorzellen hat eine entscheidende Bedeutung im Prozess der Tumorgenese. In der Tumorbiologie des UKE wurden vereinzelte dissemi-nierte Tumorzellen (DTC) aus dem Knochenmark von Tumorpatienten gewonnen und die DTC-Zelllinien PC-E1, BC-M1 und LC-M1 etabliert.
Diese drei Zelllinien wurden in der vorliegenden Arbeit näher untersucht und es konnte die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges für die DTC-Zelllinie LC-M1 nachgewiesen werden, die ein ca. 23-fach höheres Phosphorylierungsniveau von Akt(Ser473) im Ver-gleich zu der Kontrollzelllinie aufwies.
Die vorliegenden Daten zeigen weiter, dass der PI3K/Akt-Signalweg eine bedeutende Rolle für die Proliferation der DTC-Zelllinien spielt. So führte die Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs mittels des PI3K-Inhibitor LY294002 in den DTC-Zelllinien zu deutlichen Verringerungen der Phosphorylierung von Akt am Serinrest 473. Das Wachstum der DTC-Zelllinien PC-E1 und LC-M1 ließ sich durch LY294002 mit einer ähnlichen Kinetik hemmen wie die Kontrollzelllinie MTSV 1.7, während sich das Wachstum der DTC-Zelllinie BC-M1 durch die LY294002-Behandlung deutlich stärker hemmen ließ.
Neben diesem pharmokologischen Ansatz wurde auch die Asuwirkung der Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs durch Expression von SHIP1, einem negativen Regulator dieses Signalwegs, untersucht. SHIP1 ist eine Inositol-5-Phosphatase, die das von der PI3K gebildete PtdIns(3,4,5)P3, das als second messenger zur Rekrutierung von Akt führt, abbaut. Hierbei zeigte sich, dass die mit SHIP1 transduzierte und selektionierte DTC-Zelllinie LC-M1 nur eine sehr geringe SHIP1-Expression aufwies, während das auf dem Co-Expressionsvektor gelegene EGFP stark exprimiert wurde. Im Gegensatz dazu konnte in den LC-M1-Zellen eine starke Expression der enzymatisch inaktiven SHIP1-Mutante (D672A) zusammen mit EGFP nach Transduktion und Selektion erzielt werden. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass LC-M1-Zellen, die enzymatisch aktives SHIP1 exprimieren, einer negativen Selektion unterliegen. Im Weiteren wurde daher der Einfluss von SHIP1 auf das Wachstum der LC-M1-Zellen in nicht-selektionierten Zellen direkt nach Transduktion analysiert. Hierbei konnte gezeigt wer-den, dass das Wachstum der LC-M1-Zellen sowohl bei Kultivierung in serumhaltigem wie auch in serumfreien Medium gehemmt wurde. In weiterführenden Experimenten könnte nun untersucht werden, welche der drei Akt-Isoformen in den DTC-Zelllinien an der Weiterleitung der wachstumsvermittelnden Signale downstream der PI3-Kinase beteiligt ist.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Bedeutung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) für die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs in Mammakarzinom-Zelllinien untersucht. Amplifikationen des EGFR sind in einer Reihe von Malignomen inklusive des Mammakarzinoms nachgewiesen worden. Um den Einfluss der Kopien-zahl des EGFR auf die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges zu untersuchen, wurde als Modellsystem die Mammakarzinomlinie MDA-MB-468 und MDA-MB-468 EGFR-supprimiert verwendet. Während die parentale Zelllinie MDA-MB-468 eine starke Amplifikation des EGFR aufweist, die mit einer starken EGFR-Überexpression ver-bunden ist, besitzt die Zelllinie MDA-MB-468 EGFR-supprimiert nur noch 2 Kopien des EGFR und zeigt nur noch eine sehr geringe EGFR-Expression. Die in dieser Arbeit durchgeführte Untersuchung zur EGFR-abhängigen Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs in diesen beiden Zelllinien mit stark unterschiedlicher EGFR-Kopienzahl zeigte, dass überraschenderweise eine hohe Anzahl der EGFR-Kopien nicht mit einer starken Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges korrelierte. Auch konnte der PI3K/Akt-Signalweg in beiden Mammakarzionom-Linien ohne bzw. mit EGFR-Amplifikation durch den PI3K Inhibitor LY294002 in gleicher Weise signifikant gehemmt werden. Um die Bedeutung der Rezeptoren der EGFR-Familie für die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges zu analysieren, erfolgte die Inkubation der Zelllinien MDA-MB-468 und MDA-MB-468 EGFR supprimiert mit dem EGFR-Tyrosinkinase Hemmstoff Gefitinib und dem dualen EGFR- und Her2-Tyrosinkinase-Hemmstoff Lapatinib.
Der EGFR-Tyrosinkinase Hemmstoff Gefitinib konnte in der Zelllinie MDA-MB-468 EGFR supprimiert die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges schon in deutlich gerin-geren Konzentrationen hemmen als in der Zelllinie MDA-MB-468. Unter Umständen konnten die wenigen EGFR-Rezeptoren in der Zelllinie MDA-MB-468 EGFR suppri-miert wesentlich effektiver durch den EGFR-Tyrosinkinase Hemmstoff gehemmt wer-den. Erstaunlicherweise konnte der duale EGFR- und Her2-Tyrosinkinase-Hemmstoff Lapatinib die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges effektiver in der Zelllinie MDA-MB-468 hemmen, als in der Zelllinie MDA-MB-468 EGFR supprimiert.
Abschliessend erfolgte auch hier die Untersuchung des Einflusses von SHIP1 auf das Wachstum der beiden Mammakarzinom-Linien mit unterschiedlicher EGFR-Kopienzahl. Während die Expression von SHIP1 in der Zelllinie MDA-MB-468 zu einer geringen aber nicht signifikanten Abnahme der Proliferation führte, hatte die expression von SHIP1 in der Zelllinie MDA-MB-468 EGFR-supprimiert eine deutlich stärkere und signifikante Abnahme der Proliferation zur Folge. Dieser Effekt von SHIP1 war abhängig von der enzymatischen Aktivität, da die Expression einer enzymatisch inaktiven SHIP-1-Mutante in keiner der beiden Linien zu einer Wachstumshemmung führte.
Die in der vorliegenden Arbeit erworbenen Ergebnisse zeigen eine funktionelle Bedeu-tung des PI3K/Akt-Signalweges für das Wachstum von DTC- und Mammakarzinom-Linien und weisen auf eine mögliche Verwendung von SHIP1 für einen gentherapeuti-schen Ansatz zur Hemmung des Wachstums von DTCs und Mammakarzinomen hin.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/5087
URN: urn:nbn:de:gbv:18-63797
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Jücker, Manfred (PD Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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