Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during fusarium head blight infection

Abstract

Es ist erst seit sehr kurzer Zeit bekannt, dass Fusarium graminearum während der Infektion von Weizenblüten multizelluläre Appressorien bildet. Darüber hinaus wurde erstmalig eine spezifische Induktion von Mykotoxinen in Infektionsstrukturen beobachtet. Daher war es ein Ziel der hier präsentierten Arbeit, den Penetrationsmechanismus multizellulärer Appressorien von F. graminearum auf Weizenspelzen aufzuklären. Durch die Anwendung verschiedener mikroskopischer Techniken, wie Lichtmikroskopie, LSM (laser scanning microscopy), REM (Rasterelektronenmikroskopie), TEM (Transmissionselektronenmikroskopie) konnten neue Erkenntnisse über die Struktur, Entwicklung und Funktion multizellulärer Appressorien von F. graminearum erlangt werden. Die Kombination aus 3D-Aufnahmen und Elektronenmikroskopie lieferte neue, detaillierte Einblick in die zelluläre Komplexität sowie den Penetrationsmechanismus von gelappten Appressorien und Infektionskissen des Pilzes auf Spelzen von Weizen. Im Rahmen der Studie wurde gezeigt, dass gelappten Appressorien und Infektionskissen Weizenspelzen mit mehreren Penetrationsstiften durchbohren können und die Pflanze zusätzlich durch subkutikuläres Wachstum schädigen. Eine dichte Kolonisierung des pflanzlichen Gewebes durch Infektionskissen sowie Nekrosen die durch Infektionskissen entstehen lassen darüber hinaus den Schluss zu, dass Infektionskissen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese spielen. Alternative Wege um in das Innere von Weizenspelzen zu gelangen, wie z.B. über Stomata oder Silikatzellen, wurden ebenfalls beobachtet. Es wird eine bisher unbekannte Komplexität bezüglich der Penetrationsmechanismen von F. graminearum auf Weizen deutlich. Mikroskopische Untersuchungen von Mutanten von F. graminearum deuten darauf hin, dass die Bildung multizellulärer Appressorien durch eine endogene Adenylat-Zyklase in einen cAMP vermittelten Signaltransduktionsweg induziert wird. Hingegen scheint die MAP kinase GPMK1 des Pilzes für die Penetration der pflanzlichen Zellwand verantwortlich zu sein. Entgegen der Ergebnisse, die von anderen phytopathogenen Pilzen bekannt sind, ist das PLS1 Gen von F. graminearum nicht notwendig für die erfolgreiche Penetration der Pflanze. Es konnten jedoch Hinweise dafür geliefert werden, dass die Entwicklung des Pilzes und der Infektionsstrukturen auf Weizenspelzen durch den Transport spezieller mRNAs reguliert wird. Deletionsmutanten der bekannten Virulenzfaktoren des FHB an Weizen, FGL1 und TRI5, zeigten hingegen keine Beeinträchtigung bezüglich der Infektion von Weizenspelzen gegenüber dem Wildtyp. Da beide Mutanten nicht in der Lage sind Weizenähren über den Rachisknoten der Ähre hinaus systemisch zu kolonisieren, kann von einer Funktion der Virulenzfaktoren zu einem späteren Zeitpunkt der Weizeninfektion ausgegangen werden. Mit dem Ziel Erkenntnisse über die molekularen Grundlagen und Regulationsmechanismen von Infektionskissen zu erhalten wurde Laser-Mikrodissektion angewendet. Dadurch wurden hunderte Laufhyphen und Infektionskissen von F. graminearum separat gesammelt und deren mRNA isoliert. Durch SMART-PCR konnten cDNA Bibliotheken von Laufhyphen und Infektionskissen hergestellt werden. Die Nukleotidsequenzen der amplifizierten Transkripte wurden mittels Illumina HiSeq 2000 Sequenzierung mit hoher Genauigkeit bestimmt. Durch den Vergleich der ermittelten Sequenzen mit dem Referenzgenom von F. graminearum wurden mehr als 13.800 Gene des Pilzes in Laufhyphen und Infektionskissen identifiziert. Unterschiede in der Expression von Laufhyphen und Infektionskissen konnten durch differenzielle Expressionsanalysen nachgewiesen werden. Anhand der Transkriptionsanalysen wurden in Laufhyphen und Infektionskissen über 700 differentiell regulierte Gene ermittelt. Desweiteren bestätigen die Expressionsprofile von Laufhyphen und Infektionskissen Ergebnisse mikroskopischer Untersuchungen mit dem TRI5prom::GFP Reporterstamm während der Infektion von Weizenspelzen. Dadurch wurde überprüft, dass die Expressionsprofile der Situation im lebendenden System entsprechen. Letztlich wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig Transkriptomdaten von Infektionskissen und Laufhyphen eines phytopathogenen Pilzes auf seiner Wirtspflanze geliefert. Insgesamt wird durch diese Arbeit das Potential kombinierter mikroskopischer und molekularer Methoden für zellspezifische Expressionsstudien in Pathogen-Pflanze-System demonstriert.

It was discovered very recently that Fusarium. graminearum forms specialised infection structures, so-called compound appressoria during infection of floret tissues of wheat. Furthermore, a specific mycotoxin induction in infection structures was initially observed. Therefore, one aim of the presented study was to clarify the penetration mechanism of compound appressoria formed by Fusarium graminearum on wheat husks. By applying various microscopical techniques, including LM (light microscopy), LSM (laser scanning microscopy), SEM (scanning electron microscopy), and TEM (transmission electron microscopy) developmental, structural, and functional characteristics of compound appressoria were revealed. The combination of 3D imaging by LSM with electron microscopy provided a detailed insight in the cellular complexity and the penetration mechanism of lobate appressoria and infection cushions of F. graminearum on wheat husks (paleas and glumes). Multiple penetration pegs at infection cushions, subcuticular colonisation, and a dense colonisation of the plant tissue below infection cushions indicate a high impact of these infection structures for disease severity. Several possibilities for F. graminearum to enter wheat husks were identified. In summary, an unknown complexity of the penetration strategy of F. graminearum during FHB on wheat was discovered. Concerning this, striking similarities to other fungi, including R. solani and S. sclerotiorum are noted. Microscopic observations of several mutants of F. graminearum provide indications that the compound appressoria formation is induced in a cAMP dependent pathway, which is mediated by an endogenous adenylate cyclase. In contrast to that, the GPMK1 MAP kinase pathway in F. graminearum is dispensable for induction and development of infection structures, but essential for penetration of the plant cell wall of wheat. Surprisingly, the deletion mutant of the tetraspanin encoding gene PLS1 of F. graminearum was not defective in plant penetration, as it is described for several other phytopathogenic fungi. The speed of fungal development during initial infection in general and with regard to infection structures seems to be regulated by a hyposine dependent pathway with a possible function in specific mRNA transport. The deletion mutant of the lipase1, a known virulence factors for systemic FHB infection by F. graminearum, showed no defect during initial infection stages and infection structures. This supports former suggestions that lipase1 is important at the rachis of wheat spikes, where the mutant gets stuck. In contrast, trichothecene production in infection structures of F. graminearum is not a requisite for initial infection stages. Development of infection structures and disease symptoms are formed by the TRI5 deletion mutant on wheat husks similar to the wild type. In order to understand the molecular basis of infection cushions, a laser microdissection (LMD) approach was established. Thereby, several hundred runner hyphae and infection cushions were collected, mRNAs from both tissues isolated, and amplified by SMART-PCR to provide tissue specific cDNA libraries. Next generation sequencing of the resulting libraries by Illumina HiSeq 2000 determined the sequences with a high accuracy. Over 13.800 genes of F. graminearum were identified in runner hyphae and infection cushions by mapping to the reference genome. The transcriptome profiles of runner hyphae and infection cushions revealed more than 700 hundred differentially expressed genes in both tissues. Microscopic observations from a TRI5prom::GFP reporter strain in planta and differential expression results are congruent. Thereby, an authentic representation of the respective living situation by the corresponding expression data set is implied. The first transcriptome data of runner hyphae and infection cushions from a fungal plant pathogen under in planta conditions are provided here. In summary, the power of combined microscopic and molecular approaches to analyse cell type-specific gene expression during fungal-plant-interactions is demonstrated in this thesis.