Funktionelle Mutationsanalyse des Hitzeschockproteins 90 aus Leishmania donovani (Ross, 1903)

Abstract

Die Leishmaniose ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit, die häufig mit Armut assoziiert ist. Diese Erkrankung wird durch die obligat intrazellulären Protozoen der Gattung Leishmania (L.) verursacht und von der weiblichen Sandmücke auf verschiedene Säugetiere und den Menschen übertragen. Im Verlauf ihres parasitären Lebenszyklus passen sich die Parasiten an zwei extrem unterschiedliche Umgebungen an. Diese Umgebungen sind der Darm der Sandmücke sowie das Phagolysosom der Säugetiermakrophagen. Während der Übertragung von Leishmanien durch einen poikilothermen Vektor auf einen homoiothermen Wirt erfährt der Erreger drastische Veränderungen der Umgebungsbedinungen. Der rapide Temperaturanstieg während der Übertragung induziert die sogenannte Hitzeschock-Antwort, die direkt mit der Stadienumwandlung des Parasiten assoziiert ist. Der Temperaturanstieg in Kombination mit einem sauren pH, wie im Phagolysosom des infizierten Makrophagen, führen in vitro und in vivo zu einer Differenzierung der Promastigote zur pathogenen Amastigote. Welche molekularen Mechanismen der Stadienumwandlung zu Grunde liegen ist noch weitgehend unbekannt. Bekannt ist aber, dass im Zusammenhang mit der zellulären Hitzeschock-Antwort die Synthese der Hitzeschockproteine (Hsps) induziert wird. Die pharmakologische Inhibition von Hsp90, eines hoch-abundanten Mitglieds der Hsp-Familien, durch Geldanamycin (GA) oder Radicicol (RAD) induziert, unabhängig von Veränderungen des Umgebungsmileus die Stadienumwandlung von L. donovani in amastigoten-ähnliche Zellen. Dies weist auf eine entscheidende Rolle von Hsp90 während der Stadiendifferenzierung des Parasiten hin. Hsp90 ist ein essentielles, konserviertes und konstitutiv exprimiertes Protein, dass in allen bislang untersuchten Organismen an diversen zellulären Prozessen beteiligt ist. Hsp90 ist im Rahmen seiner Eigenschaften als molekulares Chaperon an der Reifung und Aktivierung einer Reihe von regulatorischen Proteinen beteiligt. Während der Reifung von Klientenproteinen interagiert Hsp90 mit einer Vielzahl von Co-Faktoren. Zu diesen zählen weitere molekulare Chaperone, wie Hsp70 und Hsp40, sowie diverse Co-Chaperone (Sti1, p23, Hip, Hop2, Sgt1). Das komplexe Zusammenspiel dieser Proteine bildet den Multichaperonen-Komplex, auch bekannt als Foldosom. Die Feineinstellungen des Multichaperonen-Komplexes wird durch diverse posttranslationale Modifikationen von Hsp90 selbst oder den beteiligten Co-Chaperonen reguliert. Da Hsp90 ein essentielles Protein ist und in Leishmania von bis zu 17 identischen Genkopien kodiert wird, ist ein Genaustausch durch homologe Rekombinantion bislang nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit erfolgte daher die Etablierung einer RAD-resistenten Hsp90-Variante in L. donovani, die es ermöglicht, die Funktion von Hsp90 besser zu charakterisieren. Die RAD-Resistenz basiert auf einem einfachen Aminosäureaustausch in der hoch-konservierten ATP-Bindungstasche von Hsp90. Hierfür wurde das Leucin an Position 33 durch ein Isoleucin ausgetauscht. Es zeigte sich, dass die Synthese der resistenten Hsp90-Variante (Hsp90rr) unter RAD-Wirkung die Proliferation der Promastigote, die Promastigoten-Morphologie und die intrazelluläre Proliferation des Amastigoten-Stadiums von L. donovani aufrecht erhält. Das endogen-kodierte Protein hingegen wird durch RAD inhibiert, was zum Wachstumsarrest des Parasiten führt. Die Analyse der Interaktion von Hsp90 mit dem essentiellen Co-Chaperon Sti1 ergab, dass diese wichtig für die Proliferation der Promastigote sowie für die intrazelluläre Vermehrung der Amastigote ist. Das Fehlen des primären Sti1-Bindemotivs am extremen C-Terminus von Hsp90 hat somit erhebliche Auswirkungen auf beide Parasitenstadien. Leishmanien verfügen über ein leicht abgeändertes Sti1-Bindemotiv (N‘ MEQVD-C‘). Ein Glutaminsäure-Austausch an Position Glutamin698 resultierte in der konservierten Bindesequenz für Sti1 (N-‘MEEVD-C‘). Die Synthese des konservierten Bindemotivs unterstützt die Proliferation der Promastigote sowie die intrazelluläre Vermehrung der Amastigote und hat somit keine negativen Auswirkungen auf beide Parasitenstadien. Warum Leishmanien über ein leicht verändertes Sti1-Bindemotiv verfügen ist bislang unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich die Rolle von sieben identifizierten Phosphorylierungsstellen (P-Stellen) in der Hsp90-Sequenz aus L. donovani untersucht. Hierfür wurden die phosphorylierbaren Aminosäuren in der Hsp90rr-Sequenz durch Alanine ersetzt, was eine Dephosphorylierung imitiert. Durch diese Untersuchung konnten zwei amastigoten-spezifische P-Stellen identifiziert werden, von denen eine dieser beiden Stellen für Leishmania-Hsp90 spezifisch ist. Welche Kinasen an der Hsp90-Phosphorylierung in L. donovani beteiligt sind ist bislang noch unbekannt. Dennoch deuten die in dieser Arbeit gewonnen Daten auf eine direkte Verbindung von Signaltransduktionswegen und dem Chaperonensystem in Leishmanien hin. Die Etablierung einer RAD-resistenten Hsp90-Varianten in L. donovani und die dadurch bereits gewonnenen Erkenntnisse eröffnen nun die Möglichkeit, die komplexe Rolle von Hsp90 während der Stadiendifferenzierung des Parasiten besser zu verstehen.

Leishmaniasis is a poverty-related infectious disease with worldwide impact. It is caused by obligate intracellular parasitic protozoa of the genus Leishmania (L.) that are transmitted to the mammalian host via female sandflies. In the course of their parasitic life cycle, the parasites encounter two very extreme environments - the gut of the sandfly and the phagolysosome of mammalian macrophages. During the transmission of Leishmania spp from a poikilothermic insect vector to a homoeothermic mammalian host the parasite encounter a significant increase of ambient temperature. The increase in temperature induces a heat stress response that is directly associated with the stage differentiation of the parasite. This temperature increase combined with the acidic mileu in the phagolysosomes of infected macrophages induces the conversion from the promastigote stage to the pathogenic amastigote stage, but also the synthesis of heat shock proteins (Hsps). Only limited information exists about the molecular mechanisms that regulate this stage conversion. Pharmacological inhibiton of Hsp90, an abundant member of the Hsp family, with geldanamycine (GA) or radicicol (RAD) mimics the environmental signals and induces conversion into amastigote-like cells. This indicates a crucial role for Hsp90 during stage conversion of the parasite. Hsp90 is an essential, conserved and constitutively expressed chaperone that is involved in a variety of cellular processes in all studied organisms. In the context of its capacity as a molecular chaperone Hsp90 is associated with the maturation and activation of a variety of signalling client proteins. During the maturation of clients, Hsp90 interacts with a varity of co-factors. These co-factors include other members of the Hsp-family, like Hsp70 and Hsp40, and co-chaperones (Sti1, p23, Hip, Hop2, Sgt1). The complex interplay of these proteins assembels the multi-chaperone-complex, the so called foldosome. The fine-tuning of the multi-chaperone-complex is regulated by posttranslational modifications. These modifications can occur directly on Hsp90 or indirectly on co-chaperones. The essential nature of Hsp90 and the large gene copy number in Leishmania have precluded an analysis of this important protein by gene replacement strategies. To remedy this, a RAD-resistant Hsp90-variant in L. donovani was established in this work. This allowed to assess the function of Hsp90 in more detail. The RAD-resistance is caused by a simple leucine to isoleucine amino acid substitution at position 33 in the highly conserved ATP-binding pocket of Hsp90. The synthesis of the RAD-resistant Hsp90-variant (Hsp90rr) allows proliferation of the promastigote stage, maintanace of promastigote morphology and intracellular survival of the amastigote stage of L. donovani under RAD inhibition where the endogenously encoded protein is inhibited by RAD. The analysis of the Hsp90-Sti1 interaction showed that this interaction is crucial for both life cycle stages. The deletion of the Sti1 recognition motif a the extrem C-terminus of Hsp90 had substantial consequences on both parasite stages. In Leishmania-Hsp90, the Sti1 binding site (N‘-MEEVD-C‘) bears a variation from the canonical pentapeptide sequence (N‘-MEQVD-C‘). Introduction of the standard N‘-MEEVD-C‘ pentapeptide led to a sligthly increased in vitro growth and infectivity. The implications of this apparently suboptimal Sti1 recongnition motif are so far unknown. The system also allows to analyse the importance of seven phosphorylation sites (P-sites) in Hsp90. For this approach the serine or threonine moieties of P-sites were replaced by alanines, thereby mimicking dephosphorylation. Two P-sites of Hsp90 are phosphorylated in an amastigote-specific manner, of which one P-site is specific for Leishmania-Hsp90. The kinases that phosphorylate Hsp90 in L. donovani are so far unknown, however gathered datae indicate that there is a crucial link between signal transduction pathways and the Leishmania chaperone system. The newly established Hsp90rr inhibition/complementation system will allow further studies aimed at understanding the complex role of Hsp90 during stage conversion of Leishmania.