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Titel: Immunobiology of SCNT derived Embryonic Stem Cells : Foreign mitochondria as an immunological barrier
Sonstige Titel: Immunbiologie SCNT-generierter embryonaler Stammzellen : Fremde Mitochondrien als eine immunologische Hürde
Sprache: Englisch
Autor*in: Ricklefs, Franz Lennard
Schlagwörter: Embryonic Stem Cells; SCNT; Mitochondria; Immunobiology
GND-Schlagwörter: Embryonale Stammzelle; Immunbiologie; Mitochondrium; Kerntransplantation
Erscheinungsdatum: 2013
Tag der mündlichen Prüfung: 2013-12-02
Zusammenfassung: 
Benutzt man einen somatischen Zellnukleustransfer (SCNT) zur Gewinnung von embryonalen Stammzellen (ESC), muss im Voraus der Nukleus einer somatischen Zelle in das Zytoplasma einer enukleierten Oozyte injiziert werden. Die daraus resultierenden ESCs sind nicht zu 100% genetisch identisch zu ihrem Nukleus-Spender, da sie die mitochondriale DNA (mtDNA) des Eizell-Spenders tragen.

In meiner Doktorarbeit befassten wir uns mit der Frage, ob es zu einer Abstoßungsreaktion gegen die fremde mtDNA im Rahmen einer ESC Transplantation kommt. Die SCNT-ESCs trugen den Nukleus einer Balb/C Maus und die Mitochondrien des BDF1 Stamms. Somit
waren sie entweder aufgrund ihres Nukleus oder ihrer Mitochondrien inkompatibel zu dem Balb/C oder BDF1-Empfänger. Immundefiziente SCID beige Mäuse wurden als Negativkontrollen benutzt. Für die Positivkontrolle injizierten wir Balb/C-ESC in BDF1 Mäuse, wobei sich jeweils der Nukleus und die Mitochondrien genetisch vom Empfänger unterschieden. Außerdem differenzierten wir die SCNT-ESCs in Kardiomyozyten ähnliche Zellen (CMs) und untersuchten die MHCI-Expression sowie die mitochondriale Aktivität. Zur Visualisierung und Bestimmung der mitochondrialen Aktivität wurde der TMRM (ausschreiben)-Versuch durchgeführt.

Allogene Mitochondrien sowie fremde Nuklei lösten im ELISPOT für Th1-, Th2- und Th17- Zellen eine ähnliche Immunantwort aus. Beide Versuchsgruppen zeigten eine signifikant höhere Immunantwort als SCID beige Mäuse (p<0.001). Dies zeigte sich auch in der Bildung von donorspezifischen Antikörper, welche auf eine Aktivierung des humoralen Immunsystems hindeuten. Eine Reinjektion von ESCs resultierte in einer adaptiven Immunantwort, was auf eine Beteiligung von reaktiven T-Zellen in der Immunreaktion hinweißt. Die Antigenität von allogener mtDNA und fremden Nuklei wurde zusätzlich durch longitudinale in-vivo BLI Messungen untersucht. Hier zeigte sich eine potente Abstoßungsreaktion durch allogene Mitochondrien. Mit der Differenzierung von SCNT-ESC in CMs erhöhte sich die Expression von MHCI-Molekülen und die Aktivität der Mitochondrien. Durch die Differenzierung in CMs zeigte sich zusätzlich eine erhöhte Antigenität der transplantierten Zellen.

Obwohl die mtDNA nur für 13 Proteine kodiert, kommt es bei ihrer Transplantation zu einer Aktivierung des adaptiven Immunsystems mit donor-spezifischer Antikörperproduktion, wodurch es zu einer Abstoßung der transplantierten Zellen kommt. Mit der Differenzierung in CMs erhöhte sich die MHCI-Expression sowie die Aktivität der Mitochondrien, was außerdem zu einer stärkeren Immunantwort gegenüber fremden Mitochondrien führte. Demzufolge lässt sich sagen, dass SCNT-abgeleitet ESCs mit fremder mtDNA nicht das Immunsystem des Empfängers umgehen können, da sie vom Immunsystem erkannt und abgestoßen werden. Somit bräuchten auch diese Zellen eine immunmodulative Therapie für den klinischen Einsatz.

Somatic cell nucleus transfer (SCNT) was used for embryonic stem cell (ESC) extraction. The nucleus of a somatic cell of the Balb/C strain was transferred to the cytoplasm of an enucleated egg of the BDF1 strain. Resulting ESCs inherited a Balb/C nucleus and BDF1 mitochondria. Therefore they were either incompatible due to their nucleus or mitochondria when transplanted into the Balb/C or BDF1 strain.

Immunodeficient SCID beige mice were used as negative controls, whereas BDF1 mice received Balb/C-ESCs for the positive control.
Interestingly, in ELISPOT assays for Th1, Th2, and Th17-cells, foreign
mitochondria caused a similar immune response compared to ESCs with
foreign nuclear DNA, both being significantly higher than in SCID beige
(p<0.001). Similar results were observed for donor specific antibodies,
highlighting the humoral response. Re-injection of ESCs resulted in an adaptive immune response, highlighting the role of T-cell mediated rejection. Potent antigenicity of mtDNA was also observed in longitudinal in-vivo cell survival BLI measurements. Antigenicity of ESCs increased with their differentiation into SCNT-ESC-derived cardiomyocytes (CMs), correlating with increased MHCIexpression and greater mitochondrial activity. Mitochondrial activity was visualized using the TMRM assay.

In conclusion, even though foreign mtDNA codes only 13 proteins, its transplantation is sufficient to trigger an adaptive immune response and the production of donor specific antibodies. With differentiation into CMs,
mitochondrial activity and MHCI expression increased per cell, which lead to a higher immune response. Therefore, contrary to former beliefs SCNTderivatives carrying foreign mtDNA are not capable of circumventing the host’s immune system as they are recognized and rejected after transplantation, resulting in the need for immunosuppression for potential clinical applications.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/5237
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65498
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Reichenspurner, Hermann (Prof. Dr. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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