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Titel: Untersuchung der Eignung des iTRAQ-basierten, proteomanalytischen Quantifizierungsverfahrens zur Identifizierung zellulärer Mechanismen des Einflusses von Proteasominhibitoren auf die Metastasierung
Sprache: Deutsch
Autor*in: Richter, Verena
Schlagwörter: Proteomanalytik; relative Quantifizierung; iTRAQ; Proteasominhibition; Metastasierung; Proteomics; relative quantitation; iTRAQ; proteasome inhibition; metastasis
GND-Schlagwörter: Massenspektrometrie
Erscheinungsdatum: 2014
Tag der mündlichen Prüfung: 2014-03-28
Zusammenfassung: 
Das Ziel dieser Arbeit war es zu prüfen, ob mittels eines semiquantitativen, proteomanalytischen Ansatzes unter Anwendung einer Markierungsstrategie mit der Bezeichnung iTRAQ zelluläre Mechanismen identifiziert werden können, welche bei der Behandlung mit Proteasominhibitoren eine Metastasierung verhindern. Aus Studien ist bereits bekannt, dass unter dem Proteasominhibitor Bortezomib, der in Deutschland seit 2004 für die Behandlung des multiplen Myeloms zugelassen ist, die Bildung von Metastasen reduziert ist. Die hierfür verantwortlichen zellulären Mechanismen sind nur teilweise erforscht.
Als Modellsystem wurden kultivierte Endothelzellen verwendet, um die Veränderung der Proteinzusammensetzung nach Stimulation mit dem proinflammatorischen Zytokin TNF-α in An- oder Abwesenheit von Bortezomib zu untersuchen. Eine Metastasierung kann von Zytokinen wie TNF-α gefördert werden. Endothelzellen wurden verwendet, weil diese während der Metastasierung eine wichtige Rolle zum Beispiel bei der Extra- und Intravasation von Tumorzellen spielen.
Zunächst wurde ein Protokoll etabliert, mit dem die Identifizierung und Quantifizierung unter Verwendung der 8-plex iTRAQ-Reagenzien möglich war. Es konnte eine Pipeline für die bioinformatische Prozessierung von LC ESI-MS/MS-Daten unter Verwendung der Open-Source-Software OpenMS entwickelt und optimiert werden. Mithilfe der etablierten Pipeline war eine transparente Datenprozessierung gewährleistet, weil jeder einzelne Schritt der Prozessierung einsehbar war und kontrolliert werden konnte.
Eine anschließende biologische Interpretation der Ergebnisse aus der iTRAQ-Analyse in Bezug auf die Veränderung der Proteinkonzentration in An- beziehungsweise Abwesenheit von Bortezomib und TNF-α führte zu der Identifizierung von Proteinen, die bereits in anderen proteomanalytischen Studien beschrieben worden waren. Der Vergleich der experimentellen Ergebnisse aus der iTRAQ-Analyse mit Daten aus der Literatur zeigte, dass in der Literatur bereits vergleichbare Ergebnisse beschrieben worden waren, was die Eignung des iTRAQ-basierten Quantifizierungsverfahrens demonstrierte. Zudem wurden in dieser Arbeit die Proteine Vimentin, Caveolin-1, Fibronectin, Cortactin, Rab7a und Wnt-6 identifiziert, die Hinweise auf mögliche neue Mechanismen geben, die eine Metastasierung unter Proteasominhibition verhindern. Ergebnisse der LC ESI-MS/MS-Messungen konnten durch LC MALDI-MS/MS-Messungen bestätigt werden.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die iTRAQ-Technologie und das entwickelte Protokoll unter Verwendung des OpenMS-Systems geeignet sind, um Hinweise auf zelluläre Mechanismen zu sammeln. Diese Arbeit legt den Grundstein für eine weiterführende Untersuchung der vorgestellten Proteinkandidaten, was das Wissen über zelluläre Mechanismen des Proteasominhibitors Bortezomib bedeutend ausbauen würde. Weiterführende Erkenntnisse über Proteasominhibitoren versprechen eine Erweiterung der Indikation von Proteasominhibitoren und die Entwicklung neuer Therapiestrategien im Kampf gegen Krebs.

The aim of this work was to investigate if it was possible to identify novel cellular mechanisms which are involved in the inhibition of metastasis formation during the treatment with proteasome inhibitors by applying a semiquantitative proteomics approach with a labelling strategy called iTRAQ. Studies demonstrated that the proteasome inhibitior bortezomib which has been approved for patients with multiple myeloma in Germany since 2004 reduced the formation of metastases. To date, the cellular mechanisms for this effect are poorly understood.
A model with cultured endothelial cells was used in order to examine the alterations in protein composition in the cells after the stimulation with the proinflammatory cytokine TNF-α in the presence or absence of bortezomib. Cytokines like TNF-α may be responsible for increased dissemination of metastatic cancer cells. Endothelial cells were chosen because they play an important role during the metastatic processes of extravasation and intravasation of tumor cells.
Initially, a protocol was established which enabled the identification and quantification with the 8-plex iTRAQ reagents. It was possible to develop and optimize a pipeline for the bioinformatic analysis of the LC ESI-MS/MS data by using the open-source software OpenMS. The established pipeline provided transparency because it enabled the tracking and controlling of each single step of the data processing procedure.
A subsequent biological interpretation of the results of the iTRAQ-experiment based on concentration alterations in the presence or absence of bortezomib and TNF-α resulted in the identification of proteins which have already been described in other proteomics studies. The comparison of the experimental data of the iTRAQ-analysis and the literature showed that accordant results have been described in the literature before which demonstrated the plausibility of the iTRAQ labelling strategy. Furthermore, the protein candidates vimentin, caveolin-1, fibronectin, cortactin, Rab7a and Wnt-6 were identified in the iTRAQ-experiment which indicate new mechanisms responsible for the inhibition of metastasis formation under proteasome inhibition. Results of the LC ESI-MS/MS analysis were confirmed by LC MALDI-MS/MS analysis.
This work demonstrates that the iTRAQ-based technology and the developed workflow using the OpenMS system are capable of providing evidence for cellular mechanisms. Therefore, this work provides the basis for further investigations of the introduced protein candidates. Further knowledge about cellular mechanisms of the proteasome inhibitor bortezomib promises the extension of its indication and the advancement of novel therapeutic strategies.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/5375
URN: urn:nbn:de:gbv:18-67075
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Betzel, Christian (Prof. Dr. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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