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Titel: Regulation der ADP-Ribosyltransferase ARTC2.2 durch Nukleotid-induzierte Proteolyse
Sprache: Deutsch
Autor*in: Menzel, Stephan
Schlagwörter: ADAM17; Nanobody
GND-Schlagwörter: ADP-Ribosylierung; Proteolyse
Erscheinungsdatum: 2014
Tag der mündlichen Prüfung: 2014-07-11
Zusammenfassung: 
Die ADP-Ribosyltransferase ARTC2.2 ist ein Ekto-Enzym auf T-Zellen, das die Übertragung der ADP-Ribose-Gruppe von NAD auf Membranproteine katalysiert. Die ARTC2.2-vermittelte ADP-Ribosylierung öffnet den P2X7-Ionenkanal und induziert membrannahe Proteolyse (Shedding) von Oberflächenproteinen durch ADAM- Proteasen. Vorarbeiten unserer Gruppe zeigten, dass ARTC2.2 nach Behandlung von T-Zellen mit Phorbolestern proteolytisch von der Zellmembran abgestoßen wird. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ARTC2.2 auch durch Nukleotid-induziertes Shedding freigesetzt werden kann. Hierfür wurde der Verlust von ARTC2.2 nach Behandlung der Zellen mit NAD und verschiedenen Inhibitoren untersucht. Es zeigte sich ein NAD-induzierter Verlust von ARTC2.2 von der Zelloberfläche in Abhängigkeit von der Aktivität von ARTC2.2, P2X7 und ADAM-Proteasen. Die ARTC2.2 konnte nach Shedding aus dem Überstand aufgereinigt und F239/S240 als Spaltstelle massenspektrometrisch bestimmt werden.
Mittels radioaktiver Markierung von Zielproteinen nach Inkubation mit 32P-NAD wurde gezeigt, dass die ARTC2.2 nach Shedding (sARTC2.2) enzymatisch aktiv ist und eine veränderte Substratspezifität, von Membranproteinen hin zu sekretorischen Proteinen, aufweist. sARTC2.2 ADP-ribosyliert einige Zytokine - darunter bevorzugt Interferon-γ (IFN-γ). Die ADP-Ribosylierung von IFN-γ wurde näher untersucht und Arginin 128 als ADP-Ribosylierungsstelle bestimmt. Assays zur IFN-γ-vermittelten Induktion der STAT1-Phosphorylierung und der Bildung des Immunoproteasoms zeigten, dass die ADP-Ribosylierung IFN-γ inhibiert und ferner, dass diese Inhibition durch de-ADP-Ribosylierung mit der ADP-Ribosyl-Hydrolase 1 reversibel ist.
Da ADAM17 als induzierbares Shedding-Enzym gilt, wurden ADAM17-spezifische Antikörper als experimentelle Werkzeuge hergestellt. Hierzu wurden einerseits ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper (K133) generiert, andererseits aus der Lymphozyten-RNA zweier immunisierter Lamas Phagemidbibliotheken kloniert und spezifisch ADAM17-bindende Nanobodies über die Phagen-Display-Technologie selektioniert. Nanobody-Fc-Fusionsproteine (Nb-Fc) wurden kloniert, produziert und charakterisiert. Zwei Nb-Fcs (ST127 und ST161) zeigen hohe Affinitäten für ADAM17. K133, ST127 und ST161 sind in ELISA, Immunfluoreszenz sowie Western- Blot-Analysen einsetzbar. ST127 und ST161 erkennen spezifisch die katalytische Domäne bzw. die Prodomäne. Diese Antikörper stellen wertvolle Werkzeuge für die weitere Analyse der ADAM17 dar.

The ADP-ribosyltranferase ARTC2.2 is an ecto-enzyme on the cell surface of T cells that catalyzes the transfer of ADP-ribose from NAD to cell surface proteins. ARTC2.2-mediated ADP-ribosylation activates the P2X7 ion channel and induces ADAM protease-mediated shedding of membrane proteins. As previously shown by our group, ARTC2.2 is released from the cell surface of T cells upon stimulation with phorbol esters. To determine whether ARTC2.2 is also shed via nucleotide-induced ADAM activation, cells were treated with NAD and different inhibitors. The results show that NAD induces ARTC2.2-, P2X7- and ADAM-dependent cleavage of ARTC2.2 from the cell surface. Shed ARTC2.2 (sARTC2.2) was purified from the supernatant of nucleotide treated cells. Mass spectrometry identified F238/S240 as the cleavage site of ARTC2.2.
Radioactive labeling of target proteins after treatment with 32P-NAD revealed that sARTC2.2 is enzymatically active and has an altered substrate specificity, now preferring secreted proteins over membrane proteins. sARTC2.2 can ADP-ribosylate a number of cytokines with preference for interferon-γ (IFN-γ). ADP-ribosylation of IFN-γ was analyzed further and arginine 128 - located in the functionally important C- terminal region - was identified as the primary ADP-ribosylation site. In assays of IFN-γ-induced STAT1 phosphorylation and assembly of the immunoproteasome it was shown that ADP-ribosylation inhibits IFN-γ and that this inhibition could be restored by de-ADP-ribosylation catalyzed by the ADP-ribosyl hydrolase 1.
ADAM17 is the major inducible sheddase. ADAM17-specific antibodies were developed as new experimental tools. Firstly, a polyclonal rabbit antibody - K133 - was generated. Secondly, nanobodies were generated by cloning phage display libraries from lymphocyte RNA of immunized llamas and selection of specific phages by panning on immobilized ADAM17. Nanobody-Fc fusion proteins (Nb-Fc) were cloned, produced and characterized. Two Nb-Fcs - ST127 and ST161 - show high affinities for ADAM17. K133, ST127 and ST161 can be used in immunofluorescence, ELISA and Western-blot analyses. ST127 and ST161 recognize epitopes on the ADAM17 catalytic domain and prodomain, respectively. These nanobodies provide useful tools for further analyses of ADAM17.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/5513
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68716
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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