Identifizierung von shRNAs gegen TGF‑β-abhängige Signalproteine für den Knockdown in murinen regulatorischen T‑Zellen

Abstract

Regulatorische T‑Zellen (Treg) vermitteln zelluläre Toleranz und spielen eine große Rolle in der Aufrechterhaltung der Balance zwischen Immunabwehr und Toleranz gegenüber Antigenen. Induzierte Treg (iTreg) sind eine Unterform der Treg. Diese iTreg werden aus naiven T‑Zellen in der Peripherie durch Antigen-Präsentation in einem tolerogenen Kontext konvertiert. Ein wichtiger Bestandteil dieses tolerogenen Kontextes ist das Zytokin TGF‑β, dessen Signalwirkung über den TGF‑β-Rezeptor zur Konversion dieser Zellen zu iTreg führt und auch für die Aufrechterhaltung der Funktion der iTreg notwendig ist. Verschiedene Signalkaskaden vermitteln die Wirkung des TGF-β in T‑Zellen. Manipulationen an den Signalkaskaden in Mausexperimenten, beispielsweise die Inhibition von Kinasen durch Inhibitoren, modulieren somit die Anzahl und Funktionalität der iTreg. Beispielsweise vermindert die Inhibition der MAP-Kinase p38 die Konversion zu iTreg, die Inhibition der Kinase mTor verstärkt die Konversion. Limitierend sind hierbei die Halbwertszeit und die eingeschränkte in vivo-Anwendbarkeit der Inhibitoren. Mittels RNA-Interferenz sind in vivo-Langzeitversuche in Hinblick auf die Konversion von T‑Zellen zu iTreg denkbar. Wenn eine shRNA durch lentivirale Transduktion dauerhaft in das Genom einer T‑Zelle integriert wird, können z. B. TGF‑β-abhängige Kinasen dauerhaft in dieser T‑Zelle und allen aus ihr hervorgehenden T‑Zellen stillgelegt werden (Knockdown). Für diese Arbeit wurden Zellen der murinen NIH/3T3-Fibroblastenlinie verwendet um zunächst ohne primäre T‑Zellen aber zumindest mit Zellen der gleichen Spezies arbeiten zu können. Es konnte nachgewiesen werden, dass die MAP-Kinase p38, der Kinase mTor und die beiden Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 durch exogenes TGF‑β aktiviert werden. Anschließend wurde für jedes der genannten Proteine mindestens eine shRNA identifiziert, die einen Knockdown des Proteins um mindestens 50 % im Vergleich zur Kontrolle vermittelt. Im Zeitverlauf hielt der Knockdown von p38 und Smad2 bis zu zwei Wochen an. Als Vektorsystem für die lentivirale Transduktion wurden für alle shRNAs LeGO-Vektoren mit verschiedenen Fluoreszenzproteinen verwendet, die eine einfache Transduktionskontrolle sowie eine Kombination mehrerer shRNAs erlauben. Diese Arbeit stellt einen Schritt auf dem Weg zum dauerhaften Knockdown von TGF‑β-abhängigen Kinasen mittels lentiviral transduzierter shRNAs in T‑Zellen dar. Diskutiert werden die Aussichten einen dauerhaften Knockdown zu erreichen und die Möglichkeiten, die derlei Experimente heute bieten und zukünftig bieten könnten.