Analysis of the Mechanisms of Factor XII Activation

Abstract

The plasma contact system is a complex proteolytic cascade activated by binding of factor XII (FXII) zymogen to negatively charged surfaces to form active FXII species. Active FXII triggers an inflammatory response by the proteolytic release of bradykinin (BK) from its precursor high molecular weight kininogen (HK) and the intrinsic pathway of coagulation. FXII deficient individuals do not suffer from any bleeding disorder and are, in addition, protected against thrombosis. Therefore, FXII has become an interesting target for the development of anti-thrombotic drugs. Studies of the FXII revealed that coagulation occurs depending on the molecule activating FXII: activation of FXII by Polyphosphate (PolyP) induces coagulation whereas, activation by dextran sulfate (DXS) does not. FXII activated by either molecule induces the bradykinin formation. The aim of this work was to decipher the molecular mechanisms underlying FXII activation by PolyP and DXS. The plasma proteome was analyzed with mass spectrometry after separation of the intact proteins on an SDS-PAGE. This migration profile assay allows for the identification of different protein species within complex protein mixtures such as plasma, which are formed by proteolytic degradation or formation of fusion proteins by e.g. covalent binding of proteases to their inhibitors. FXII activation by PolyP results in a full-length active FXII-species whereas activation with DXS results in a proteolytically cleaved two chain FXII-species. Both species promote HK cleavage and as a result BK release. Moreover, it was shown that in presence of DXS, the serine protease inhibitor antithrombin III is activated. The activation of FXII by PolyP results in the proteolytically activated hyaluronan binding protein 2 (HABP2). From these results it can be concluded that in vivo DXS-like molecules inhibit the coagulation cascade via factor XI (FXI) and PolyP enhances coagulation via factor VII (FVII). Activation of FXII by PolyP results in the proteolytic processing of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4 (ITIH4). The proteolytically cleaved species of ITIH4 is able to bind to bikunin enhancing its inhibitory activity towards proteases. However, the exact role of the ITIH4-bikunin complex with respect to the contact system remains to be discovered. In summary, the activation mechanisms of FXII by PolyP and DXS could be explained by identification of the resulting protein species. These FXII species have a different conformation and specificity that influence the coagulation cascade in a different manner.

Die Kontaktsystemaktivierung erfolgt durch das Binden des Faktor XII (FXII)-Zymogens an negativ geladene Oberflächen. Die aktivierte FXII-Spezies löst eine proteolytische Kaskade aus. Die ablaufenden proteolytischen Prozesse führen zur Spaltung von hochmolekularem Kininogen (HK) und in der Folge zur Freisetzung des Peptidhormons Bradykinin (BK). BK wiederrum löst eine Entzündungsreaktion aus. Zusätzlich zur Entzündungsreaktion aktiviert FXII auch die intrinsische Gerinnungskaskade. Interessanterweise zeigen FXII-defiziente Individuen keinerlei Gerinnungsstörungen. Diese Besonderheit macht FXII zu einem interessanten Ziel für antithrombotische Wirkstoffe. In Studien zur FXII-Aktivierung wurde gezeigt, dass FXII durch Polyphosphat (PolyP) und Dextransulphat (DXS) aktiviert wird und nachfolgende Entzündungsprozesse eingeschaltet werden. Durch PolyP aktiviertes FXII führt zusätzlich zur Aktivierung der intrinsischen Gerinnung. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der FXII-Aktivierung durch PolyP und DXS zu identifizieren. Zur Beantwortung dieser Frage wurde ein sogenannter Migrationsprofil-Assay genutzt. Dieser Ansatz erlaubte es, die durch Proteolyse entstanden unterschiedlichen Proteinspezies aus einem komplexen Proteingemisch zu identifizieren. Mittels der Migrationsprofile lassen sich auch Fusionsproteine bestehend aus Protease und Inhibitor, wie zum Beispiel der FXII–C1-Inhibitor-Komplex, identifizieren. Die PolyP-vermittelte FXII-Aktivierung resultierte in einer aktiven FXII-Spezies in voller Länge. Hingegen führte die DXS-vermittelte FXII-Aktivierung zu einer aktiven proteolytisch gespaltenen FXII-Spezies. In beiden Fällen wurde durch proteolytische HK-Spaltung die Entzündungsreaktion induziert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von DXS der Serin-Protease-Inhibitor Antithrombin III aktiviert wird. Die Aktivierung des FXII durch PolyP hat die proteolytische Aktivierung des Hyaluronan-bindenden Protein 2 (HABP2) zur Folge. Aus diesen Ergebnissen kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass in vivo DXS-ähnliche Moleküle die Gerinnung über Faktor XI inhibieren und PolyP die Faktor-VII-vermittelte Gerinnung unterstützt. FXII-Aktivierung hat auch eine proteolytische Spaltung von Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4 (ITIH4) zur Folge. Die proteolytisch gespaltene ITIH4-Spezies kann an Bikunin binden, sodass Bikunin seine Proteaseinhibitorfunktion entfalten kann. Dennoch sind die genauen Funktionen und Mechanismen des ITIH4-Bikunin- Komplexes weiterhin unbekannt. Zusammenfassend konnten die Aktivierungsmechanismen des FXII durch PolyP und DXS anhand der nachgewiesenen unterschiedlichen Proteinspezies erklärt werden. Diese haben eine deutlich unterschiedliche Konformation und Substratspezifität, welche die Gerinnung unterschiedlich beeinflussen.