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Titel: Selektion von DNA-Aptameren für CD24 und andere medizinisch relevante Oberflächenproteine
Sonstige Titel: Selection of DNA aptamers for CD24 and other medically relevant surface proteins
Sprache: Deutsch
Autor*in: Fafińska, Joanna Aleksandra
Schlagwörter: Aptamere; CD24-Protein; CD54-Protein; Embp-Protein; Zell-SELEX
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-10-18
Zusammenfassung: 
Diese Arbeit beschreibt die Etablierung verschiedener Methoden zur Selektion von DNA-Aptameren für drei Oberflächenmoleküle, die Gegenstand aktueller Krebs- oder bakterieller Biofilm-Forschung sind. Das Protein cluster of differentiation 24 (CD24) ist ein Zelloberflächenglykoprotein, das vor allem auf hämatopoetischen Zellen und auf vielen Arten von Tumorzellen präsentiert wird. Das CD24-Gen wird als Onkogen bezeichnet und der Grad der Überproduktion des Genproduktes korreliert mit der Schwere der Krebserkrankung. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch wenig erforscht. Allerdings wurde gezeigt, dass das Targeting von CD24 mit verschiedenen Antikörpern das Fortschreiten der Krankheit hemmt. Das zweite eukaryotische Oberflächenmolekül, cluster of differentiation CD54, das auch als ICAM-1 bekannt ist, ist nicht nur für die Adhäsion der Zellen verantwortlich, sondern auch für die daraus resultierende Extravasation (Migration in umgebende Gewebe). Dieser Vorgang spielt vor allem bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle, um die Leukozyten zu deren Wirkungsort zu bringen. Auch die Krebszellen können diesen Mechanismus zur organotropen Metastasierung nutzen. Das große extracellular binding Protein (Embp) kommt auf der Oberfläche von prokaryotischen Zellen vor. Es kann an die humane Fibronektin-Domäne-III (FNIII) binden und dadurch dem Bakterium Staphylococcus epidermidis seine Virulenz verleihen. Nukleinsäure-Aptamere (in dieser Arbeit kurz Aptamere genannt) sind Oligonukleotide, die in einem als SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) bezeichneten Selektionsprozess aus zufälligen DNA- oder RNA-Bibliotheken aufgrund ihrer hohen Affinität und spezifischen Bindung an ein bestimmtes Zielmolekül angereichert werden. Aptamere können somit als Alternative zu Antikörpern verwendet werden. Um einen Einblick in die Rolle der drei oben genannten Oberflächenproteine und deren Interaktionspartner zu erhalten, sollten in der vorliegenden Arbeit entsprechende Aptamere selektiert werden, wobei mehrere SELEX-Experimente durchgeführt, variiert und evaluiert wurden. Für zwei Fragmente des Embp-Proteins (Embp125 und 170) wurden mittels dreier SELEX-Methoden nicht nur für beide Fragmente targetaffine Pools erhalten, sondern auch Moleküle identifiziert, die durch das Vorhandensein charakteristischer Sequenz- oder Strukturmotive als potenzielle Embp-Aptamere fungieren können. Eine Selektionsmethode, bei der die Primer-Regionen während der Inkubation mit dem Target blockiert wurden, resultierte in einem besonders homogenen DNA-Pool. Die nach dieser SELEX identifizierten Oligonukleotide zeigten eine höhere Stabilität im Vergleich zu den mit konventionellen Methoden selektierten DNA-Molekülen. Bei den beiden CD-Molekülen erwies sich die Zell-SELEX als Methode der Wahl. Für die Selektion von ICAM-1-affinen Nukleinsäuren wurde eine CD54 Knockdown-Variante der HCT116-Zellen eingesetzt. Die selektierten Oligonukleotid-Pools konnten spezifisch an das ICAM-1-Molekül binden, welches von der parentalen HCT116 Zellinie präsentiert wird. CD24-spezifische DNA-Aptamere können dazu beitragen, bessere Einblicke in die Rolle von CD24 und seiner Interaktionspartner zu erhalten. Zur Optimierung wurden auch hier mehrere SELEX-Experimente durchgeführt. Dabei wurden sechs Aptamere mithilfe einer Zell-SELEX mit HT-29-Zellen sowie der CD24 Knockdown-Variante dieser Zellinie selektiert und anschließend analysiert. Für eine Auswahl dieser Aptamere wurden Dissoziationskonstanten im nanomolaren Bereich (18–709 nM) mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Strukturanalyse des stärksten Binders CD24A_2 zeigte, dass dieses Aptamer eine stabile G-Quadruplex-Struktur ausbildet, die nicht durch Ioneneinfluss (Li+) verloren geht. Außerdem wurde bewiesen, dass das Aptamer zu 30% von den Zellen internalisiert wird. Das steht im Einklang mit vorherigen Experimenten mit CD24-Antikörpern. Zusätzlich wurde gezeigt, dass das Aptamer nicht an der gleichen Stelle wie der CD24-Antikörper bindet. Dieses CD24-Aptamer könnte dem molecular profiling dienen. So wäre es denkbar, bestimmte somatische Veränderungen aufzuspüren und dadurch die Diagnose und Behandlung von Krebs deutlich zu verbessern. Weiterhin könnten die Aptamere als Alternative zur Immuntherapie angewendet werden, um Signalwege zu inhibieren, die den metastatischen Prozess fördern.

During this work several SELEX methods have been established to select DNA aptamers for three surface molecules that are the subject of current cancer or bacterial biofilm research. The cluster of differentiation 24 (CD24) is a surface glycoprotein that is mainly presented on hematopoietic cells and on many types of tumor cells. CD24 is an oncogene and its production rate directlycorrelates with the severity of the cancer disease. The underlying mechanisms of actions are still poorly understood. However, targeting of CD24 with various antibodies led to inhibition of the progression of the cancer disease. The second molecule in question from the eukaryotic surface was the cluster of differentiation CD54, also known as ICAM-1. It initiates binding to the cell surface and is thus responsible not only for the firm adhesion of the cells to endothelium, but also for the resulting extravasation (migration into the surrounding tissue). This process plays an important role, especially in inflammatory processes, bringing the leukocytes to their place of action. Also, cancer cells can use this mechanism for organotropic metastasis processes. The large extracellular binding protein (Embp) is presented on the surface of prokaryotic cells. It is able to bind to the human fibronectin type III domain and is responsible for the virulence of the bacterium Staphylococcus epidermidis. Nucleic acid aptamers (in this dissertation termed throughout solely as aptamers) are oligonucleotides, which are selected from random DNA or RNA libraries due to their high affinity and specific binding to a particular target molecule. Those oligonucleotides can be used as an alternative to antibodies. In order to gain insight into the role of the three surface proteins mentioned above and their inter-acting partners, several SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) experiments were performed to select corresponding DNA aptamers. In order to enrich the DNA pools with the respective target-affine molecules, different modifications of the SELEX technique were implemented. For two fragments of the Embp protein (Embp125 and 170), three SELEX methods were successfully performed. Not only pools with affinity to both targets were obtained, but also molecules, which had a characteristic sequence or structural motifs that could potentially act as Embp aptamers. A more homogeneous DNA-Pool resulted from one SELEX in which the primer regions were blocked during the incubation time compared to the conventional SELEX methods. Also, the oligonucleo-tides resulting from this SELEX showed relative higher stability. In case of the two CD molecules, cell-SELEX proved to be the method of choice. For the selection of ICAM-1 affine nucleic acids, HCT116 cells as well as the respective CD54 knockdown variant were used. The selected pool of oligonucleotides bound specifically to the ICAM-1 molecules presented on the parental HCT116 cell line. Several SELEX experiments were performed in order to select CD24-specfiic DNA aptamers. Six aptamers were successfully selected using HT-29 cells producing CD24 as well as CD24 knockdown HT-29 cells. For those aptamers, dissociation constants in the nanomolar range (18-709 nM) were determined by flow cytometry. Structural analysis of the best aptamer (CD24A_2) revealed formation of a stable G-quadruplex structure that was not destroyed in the presence of lithium ions (Li+). In addition, it was observed that 30% of the aptamer was internalized into the cells. This is in accordance with previous studies using CD24 antibodies. Moreover, the results obtained in this work showed that CD24A_2 does not interact with the target at the same site as the CD24 antibody. In conclusion, the selected CD24 aptamers could be used for molecular profiling. For example, it might be possible to detect certain somatic changes and thereby significantly improve the diagnosis and treatment of cancer. Furthermore, the aptamers could be used as an alternative to immunotherapy to inhibit signaling pathways, which can lead to cancer formation.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6085
URN: urn:nbn:de:gbv:18-101266
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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