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Titel: Die Funktionen der Homologen Rekombination und die Bedeutung der S-Phase Schadensantwort in humanen Zelllinien des Triple-negativen Mammakarzinoms
Sonstige Titel: The functions of homologous recombination and the importance of the S-phase damage response in human cell lines of triple-negative breast cancer
Sprache: Deutsch
Autor*in: Meyer, Felix
Schlagwörter: DNA-Schadensantwort; Replikation; Triple-negativer brustkrebs; DNA-damage-response; Replication; Triple-negative breast cancer
GND-Schlagwörter: Homologe Rekombination; Brustkrebs
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-09-27
Zusammenfassung: 
Etwa 15-25 % aller Mammakarzinome werden dem Triple-negativen Subtyp zugerechnet. Patientinnen mit Triple-negativem Mammakarzinom (TNBC) haben eine schlechte Prognose, die starke Heterogenität sowie das Fehlen von Hormonrezeptoren lassen wenig Spielraum für gezielte Therapieansätze. Sie zeichnen sich durch einen Defekt im DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturweg Homologe Rekombination (HR) und einen erhöhten Anteil von Tumorstammzellen aus. Die HR ist der bedeutendste DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturweg der S-Phase und ein HR-Defekt kann sich auf mehrere Aufgaben der HR auswirken: die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) mit zwei offenen Enden (zwei-endig), die Reparatur von DSBs mit einem offenen Ende (ein-endig) und die Stabilisierung geöffneter Replikationsgabeln.
Das Ziel dieser Arbeit war zu klären I) wie sich der HR-Defekt im TNBC auf die einzelnen Funktionen der HR auswirkt, II) Welche Bedeutung die DNA-Schadensantwort der S-Phase (S-Phase Schadenantwort) in TNBCs hat und III) ob sich der Anteil von Tumorstammzellen auf die Therapieresistenz auswirkt. Dies wurde in einem isogenen Zellsystem, bestehend aus drei TNBC-Zelllinien, sowie einer luminalen Vergleichszelllinie überprüft.
I) Die TNBC-Zelllinien zeigten im Vergleich zur luminalen Zelllinie eine deutlich höhere Expression des HR-Proteins RAD51 und des zentralen Proteins der S-Phase Schadensantwort, CHK1 (Checkpoint-Kinase 1). Bei der Analyse der Reparaturkapazität durch HR (HR-Kapazität), zeigten die TNBC-Zelllinien eine ausgesprochen geringe HR-Kapazität, was die eingeschränkte Funktionalität der HR in den TNBC-Zelllinien bestätigte. Weder die eingeschränkte Funktionalität der HR noch die erhöhte Expression von RAD51 und CHK1 hatten Auswirkungen auf die Stabilisierung von Replikationsgabeln, noch zeigten sie eine erhöhte Empfindlichkeit gegen Substanzen, die ein-endige Doppelstrangbrüche (DSBs) induzieren. Auch auf die Empfindlichkeit gegen Mitomycin C (MMC) hatte dies keinen Einfluss. Zwei der TNBC-Zelllinien waren ausgesprochen MMC-resistent, eine TNBC-Zelllinie und die luminale Zelllinie waren MMC-empfindlich. Dies war nicht auf eine veränderte Ausbildung von RAD51-Foci zurückzuführen, sondern auf die Akkumulation replikationsassoziierter DNA-Schäden. Insgesamt zeigte sich, dass das zelluläre Überleben nach Induktion S-Phase assoziierter DNA-Schäden weniger von der HR, sondern von der S-Phase Schadensantwort abhing.
II) Nach Schädigung zeigten die MMC-empfindlichen Zelllinien eine ausgeprägte Akkumulation einzelsträngiger DNA, was auf eine insuffiziente Phosphorylierung von CHK1 zurückgeführt werden konnte. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die verringerte Phosphorylierung von CHK1 zu einem erhöhten Anhalten- und zu einer ausgeprägten Degradation von Replikationsgabeln unter MMC-Schädigung führte, wie durch Analyse im DNA-Fiber Assay beobachtet wurde. Die MMC-resistenten Zelllinien mit ausgeprägter Aktivierung von CHK1 zeigten, trotz MMC-Schädigung, keine Veränderungen in der Elongation oder bei den Replikationsstrukturen. Die Abhängigkeit dieser Prozesse von CHK1 konnte durch Inhibition von CHK1 bestätigt werden, dies führte in den MMC-resistenten Zelllinien zu einer deutlichen Sensibilisierung gegen MMC.
III) Die TNBC-Zelllinien zeigten ein stammzellartiges Expressionsmuster und einen hohen Anteil von Zellen mit hoher Aktivität des Stammzellmarkers ALDH1 (Aldehyde-Dehydrogenase 1). Das eingesetzte Zellsystem zeigte zudem eine klare Assoziation zwischen RAD51 und CHK1-Expression und Tumorstammzellanteil. Im Gegensatz zu anderen Arbeiten korrelierte der hohe Anteil von Tumorstammzellen nicht mit der Strahlen- oder Chemoresistenz, obwohl in Übereinstimmung mit anderen Arbeiten die Expression des Stammzellmarkers ZEB1 (Zinc finger E-box-binding homeobox 1) signifikant mit der Expression von CHK1 korrelierte. Um den Zusammenhang zwischen Strahlenresistenz und Stammzellphänotyp näher zu untersuchen wurden durch hypofraktionierte Bestrahlung radioresistente Klone hergestellt, die eine deutliche Zunahme der Strahlenresistenz zeigten, was auf eine Zunahme der Tumorstammzellpopulation hindeutete.
Zusammenfassend konnte in der Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass eine hohe Expression von RAD51 und CHK1 in einem isogenen- und nicht gentechnisch veränderten Zellsystem keinen Einfluss auf die HR-Kapazität hatte. Zudem konnte bei der Analyse der HR-Funktionen gezeigt werden, dass die eingeschränkt funktionale HR in TNBC-Zelllinien von geringerer Bedeutung für die Resistenz gegen DNA-Schäden ist als die S-Phase-Schadensantwort. Es wurde erstmalig beobachtet, dass sie in besonderem Maße von CHK1 abhängig sind, um Replikationsstress zu vermeiden. Somit könnte die Inhibition von CHK1 in TNBCs ein geeigneter therapeutischer Angriffspunkt für eine gezielte Therapie sein. Der erhöhte Anteil von Tumorstammzellen in den TNBC-Zelllinien hatte hingegen keinen direkten Einfluss auf die Resistenz gegen DNA-Schäden.

About 15-25 % of all breast carcinomas are classified as triple-negative. Patients with triple-negative breast carcinoma (TNBC) have a poor prognosis, the strong heterogeneity and the lack of hormone receptors leave little scope for targeted therapeutic approaches. They are characterised by a defect in the DNA double-strand break repair pathway homologous recombination (HR) and an increased proportion of tumour stem cells. HR is the most important DNA double-strand break repair pathway of the S phase and a HR defect can affect several HR tasks: repair of double-strand breaks (DSBs) with two open ends (two-ended), repair of DSBs with one open end (one-ended) and stabilisation of open replication forks. The aim of this work was to clarify I) how the HR defect in TNBC affects the individual functions of HR, II) the significance of the DNA damage response of the S-phase (S-phase damage response) in TNBCs and III) whether the proportion of tumour stem cells affects therapy resistance. This was tested in an isogenic cell system consisting of three TNBC cell lines and a luminal reference cell line.
I) Compared to the luminal cell line, the TNBC cell lines showed a significantly higher expression of the HR protein RAD51 and the central protein of the S-phase damage response, CHK1 (Checkpoint kinase 1). In the analysis of repair capacity by HR (HR capacity), the TNBC cell lines showed very low HR capacity, confirming the limited functionality of HR in the TNBC cell lines. Neither the limited functionality of HR nor the increased expression of RAD51 and CHK1 had an effect on the stabilization of replication forks, nor did they show increased sensitivity to substances inducing one-ended DSBs. This also had no effect on sensitivity to mitomycin C (MMC). Two of the TNBC cell lines were distinctly MMC-resistant, one TNBC cell line and the luminal cell line were MMC-sensitive. This was not due to an altered formation of RAD51 foci, but to the accumulation of replication-associated DNA damage. Overall, cellular survival after induction of S-phase associated DNA damage depended less on HR and more on S-phase damage response.
II) After damage, the MMC-sensitive cell lines showed a pronounced accumulation of single-stranded DNA, which could be attributed to insufficient phosphorylation of CHK1. It could be shown for the first time that the reduced phosphorylation of CHK1 led to increased stopping and pronounced degradation of replication forks under MMC damage, as observed by DNA fiber assay analysis. The MMC-resistant cell lines with pronounced activation of CHK1 showed no changes in elongation or replication structures despite MMC damage. The dependence of these processes on CHK1 could be confirmed by the inhibition of CHK1, which led to a clear sensitization of the MMC resistant cell lines gagainst MMC.
III) The TNBC cell lines showed a tumor stem-cell like expression pattern and a high proportion of cells with a high activity of the stem cell marker ALDH1 (aldehyde dehydrogenase 1). The cell system also showed a clear association between RAD51 and CHK1 expression and tumor stem cell fraction. In contrast to other studies, the high proportion of tumor stem cells did not correlate with radiation or chemoresistance, although in accordance with other studies the expression of the stem cell marker ZEB1 (Zinc finger E-box-binding homeobox 1) correlated significantly with the expression of CHK1. In order to further investigate the relationship between radiation resistance and stem cell phenotype, hypofractionated irradiation was used to produce radioresistant clones that showed a significant increase in radiation resistance, indicating an increase in the tumor stem cell population.
In summary, it could be shown for the first time that a high expression of RAD51 and CHK1 in an isogenic and non-genetically modified cell system had no influence on HR capacity. In addition, the analysis of HR functions showed that restricted functional HR in TNBC cell lines is less important for resistance to DNA damage than the S-phase damage response. It was observed for the first time that they are particularly dependent on CHK1 to avoid replication stress. Thus, the inhibition of CHK1 in TNBCs could be a suitable therapeutic target for targeted therapy. The increased proportion of tumor stem cells in the TNBC cell lines, however, had no direct effect on resistance to DNA damage.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6087
URN: urn:nbn:de:gbv:18-101291
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Borgmann, Kerstin (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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