Role of Cannabinoid Receptor 2 in Adult Neurogenesis and cyclic AMP Signalling detected with Live Cell FRET Imaging in a Cell Model and Microglia

Abstract

In the last two decades, the G-protein coupled cannabinoid receptor 2 (CB2) has emerged as a target for treating pathophysiological processes in the central nervous system. The role of CB2 signalling in anti-inflammatory functions of microglia, its relevance for the regulation of adult hippocampal neurogenesis (AN) and the activation of cyclic AMP and MAPK pathways by CB2 and its putative interaction partners, β-adrenergic receptors (βAR), are the main aspects this work is focused on. First, the aim was to quantify the contribution of basal CB2 signalling to AN in mice. Second, the goal was to generate a HEK293 cell model that allows for the live measurement of CB2-mediated cAMP dynamics and the investigation of possible functional crosstalk with βAR in cAMP but also in MAPK pathways. The possible interaction between CB2 and the β2-adrenergic receptor (β2AR) was specifically investigated. Finally, CB2- and βAR-mediated cAMP signalling and functional crosstalk were studied in primary adult mouse microglia.

AN in the subgranular zone of the dentate gyrus was quantified in 16 to 17-week-old wildtype and CB2-deficient mice using immunostaining of brain sections for the cell proliferation marker Ki67 and neural progenitor markers doublecortin (DCX) and calretinin (CR). Quantification of AN revealed that CB2-deficiency did not impair cell proliferation or the size of the DCX+ or DCX+/CR+ cell population in the dentate gyrus.

Using HEK293 cells that stably express the FRET-based cAMP biosensor Epac1-camps, cells with additional stable heterologous expression of FLAG-hCB2 were generated (Epac1-CB2-HEK) and CB2- and endogenous βAR-mediated effects on intracellular cAMP levels were measured via live cell FRET imaging. Co-immunoprecipitation (IP) and immunocytochemistry in FLAG-hCB2 and HA-hβ2AR co-transfected HEK293 cells were used to investigate complex formation and co-localisation of the two receptors at the cell membrane and activation of the MAPK pathway was determined by detecting the phosphorylation of ERK1/2 in stimulated Epac1-CB2-HEK cell lysates via immunoblotting. With the generated cell model Epac1-CB2-HEK, it was possible to measure live CB2-mediated inhibition of cAMP production by Gαi subunits and its blockage using different CB2 ligands despite the heterogeneity of the cell model on a single cell level. Epac1-CB2-HEK cells also showed a negative cAMP feedback after Gαs-mediated cAMP production elicited by βAR agonist isoprenaline, which was reversible by the CB2 inverse agonist/antagonist AM630. Co-stimulation of CB2 and βAR led to a two-fold stronger activation of ERK1/2 in Epac1-CB2-HEK cells compared to the activation of a single receptor. Complex formation of CB2 and β2AR was demonstrated by showing the co-precipitation of HA-hβ2AR in FLAG-hCB2-IP samples and vice versa in HEK293 cells transiently transfected with both receptors. Co-localisation at the cell membrane was seen for around 24% of all positive fluorescent signals from both labelled receptors.

In a meta-analysis of mouse microglia RNAseq data, previously published research was summarised regarding the expression of GPCRs and the cAMP signalling machinery. To study endogenous CB2 and βAR effects on cAMP signalling, adult microglia from wildtype and CB2-deficient mice ubiquitously expressing Epac1-camps were isolated and live cell FRET imaging was conducted. Detection of CB2 effects on cAMP signalling in adult microglia was not possible with the present approach, however, endogenous βAR signalling was detectable and displayed a negative cAMP feedback after initial cAMP production similar to Epac1-CB2-HEK cells with variability on a single cell level.

In this work, it was shown that CB2 deficiency did not impair basal levels of AN in mice and that using a newly generated Epac1-CB2-HEK cell line to measure live cell dynamics of CB2-mediated cAMP signalling, functional crosstalk with βAR was seen, that was also detected for the MAPK pathway ERK1/2. Evidence for the interaction between CB2 and β2AR was shown in co-transfected HEK293 cells. Detection of live cAMP changes after CB2 stimulation in adult mouse microglia failed, but live cAMP signalling from βAR showed a negative cAMP feedback after initial cAMP production and heterogeneity on a single cell level. These results have implications for the role of CB2 in AN as well as for general aspects of CB2 signalling and possible interaction partners. They also provide insights into microglial cAMP signalling which may be of importance for CB2-mediated effects during neuroinflammatory processes.

Der G-Protein-gekoppelte Cannabinoid Rezeptor 2 (CB2) hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem vielversprechenden Ziel in der Behandlung pathophysiologischer Prozesse im zentralen Nervensystem entwickelt. Wichtige Aspekte, auf die sich diese Arbeit fokussiert, sind hierbei die Rolle von CB2-Signalwegen für anti-inflammatorische Funktionen von Mikroglia, seine Relevanz in der Regulation adulter Neurogenese (AN) im Hippocampus, sowie die Aktivierung von cAMP- und MAPK-Signalkaskaden durch CB2 und seinen möglichen Interaktionspartnern, den β-adrenergen Rezeptoren (βAR). Zunächst war das Ziel, den Beitrag von basaler CB2-Aktivität an AN in der Maus zu quantifizieren. Anschließend sollte ein HEK293-Zellmodel generiert werden, welches es erlaubt, die Dynamiken intrazellulären cAMPs nach CB2-Stimulation in lebenden Zellen und in Echtzeit zu messen. Die Untersuchung eines möglichen funktionellen Crosstalks mit βAR in cAMP- und MAPK-Signalwegen, sowie die Rezeptorinteraktion zwischen CB2 und dem β2-adrenergen Rezeptor (β2AR) sollten ebenso untersucht werden, wie Echtzeit-cAMP-Dynamiken in adulten Mikroglia der Maus nach der Stimulation von CB2 und βAR.

Mithilfe von Immunfluoreszenzfärbung für den Proliferationsmarker Ki67 und Markern für neuronale Progenitorzellen, Doublecortin (DCX) und Calretinin (CR), in Gehirnschnitten von 16 bis 17 Wochen alten CB2-defizienten und Kontroll-Mäusen wurde AN in der subgranulären Zone des Gyrus Dentatus quantifiziert. Die Quantifizierung von AN in CB2-defizienten Mäusen zeigte, dass CB2 keinen Einfluss auf die Zellproliferation und die Größe der DCX+ und DCX+/CR+ Zellpopulationen im Gyrus Dentatus hatte.

In HEK293-Zellen, die den FRET-basierten cAMP-Biosensor Epac1-camps stabil exprimieren, wurde ebenso FLAG-hCB2 stabil integriert (Epac1-CB2-HEK-Zellen), um Effekte von CB2 und endogenen βAR auf den cAMP-Signalweg über die Detektion von FRET in Echtzeit an lebenden Zellen zu messen. FLAG-hCB2 und HA-hβ2AR wurden in HEK293 Zellen ko-transfiziert, um per Ko-Immunopräzipitation eine mögliche Komplexbildung zu untersuchen und um per Immunfärbung und Fluoreszenzdetektion eine Ko-Lokalisierung der Rezeptoren an der Plasmamembran zu zeigen. Zelllysate von stimulierten Epac1-CB2-HEK-Zellen wurden per Western Blot analysiert und die Phosphorylierung von ERK1/2 wurde quantifiziert.

Mit dem generierten Zellmodell Epac1-CB2-HEK, welches auf Einzelzellebene Heterogenität aufweist, war es möglich, die Inhibition von cAMP-Produktion durch Gαi-Proteine nach CB2-Stimulation mit unterschiedlichen CB2-Liganden in Echtzeit zu messen, sowie diese mit CB2-spezifischen inversen Agonisten/Antagonisten AM630 zu blocken. Epac1- CB2-HEK-Zellen zeigten ebenso ein negatives cAMP-Feedback nach initialer cAMP-Produktion durch den βAR-Agonisten Isoprenalin, welches durch Stimulation mit AM630 geblockt werden konnte. Ko-Stimulation von CB2 und βAR führte zu einer doppelt so starken Aktivierung von ERK1/2 in Epac1-CB2-HEK-Zellen verglichen mit der Einzelstimulation der Rezeptoren. Die Komplexbildung von CB2 und β2AR wurde durch die gegenseitige Ko-Präzipitation von FLAG-hCB2 und HA-hβ2AR gezeigt und ebenso konnte die Ko-Lokalisierung von ca. 24% aller positiven Fluoreszenzsignale der markierten Rezeptoren an der Zellmembran detektiert werden.

RNAseq-Expressionsdaten aus murinen adulten Mikroglia wurden in einer Meta-Analyse mit Bezug auf GPCR-assoziierte cAMP-Signalkaskaden zusammengefasst und die FRET-Echtzeitmessung von CB2- und βAR-Effekten auf die intrazelluläre cAMP-Konzentration in adulten Mikroglia von Wildtyp und CB2-defizienten Mäusen mit Epac1-camps-Expression wurde durchgeführt. Obwohl es nicht möglich war, CB2-Effekte auf cAMP-Signalwege in adulten Mikroglia zu messen, konnte ein negatives cAMP-Feedback nach Stimulation von βAR, ähnlich zu Epac1-CB2-HEK-Zellen, auch in Mikroglia festgestellt werden.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich der Verlust von CB2 nicht auf die basale AN im Hippocampus auswirkt, und, dass das generierte Zellmodell Epac1-CB2-HEK die Möglichkeit zur Echtzeitmessung von CB2-Effekten auf die intrazelluläre cAMP-Konzentration möglich macht. Mit dieser Methode konnte ebenso ein funktioneller Rezeptor-Crosstalk mit βAR detektiert werden, der auch im MAPK-Signalweg gezeigt wurde. Die Interaktion zwischen CB2- und β2AR konnte in ko-transfizierten HEK293-Zellen gezeigt werden. Im Gegensatz zu CB2-Effekten, konnten das negative cAMP-Feedback nach cAMP-Produktion durch βAR-Stimulation in lebenden adulten heterogenen Mikroglia und in Echtzeit gemessen werden. Die Resultate dieser Arbeit haben Auswirkungen auf die Sicht der Rolle von CB2 in adulter Neurogenese und auf generelle Aspekte von CB2 und seinen Interaktionspartnern. Ebenso liefern sie Erkenntnisse zu cAMP-Signalkaskaden in Mikroglia, die wichtig für CB2-Effekte während neuroinflammatorischer Prozesse sein könnten.