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Titel: Establishment of new assays of exosome purification and microRNA isolation and quantification
Sonstige Titel: Etablierung neuer Assays zur Isolierung von Exosomen sowie zur Isolierung und Quantifizierung von microRNAs
Sprache: Englisch
Autor*in: Grunt, Magdalena
Schlagwörter: miRNA extraction; miRNA quantification; miR-142; miR-16; exosome purification
GND-Schlagwörter: Real time quantitative PCR; Blutserum; Blutplasma
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-11-08
Zusammenfassung: 
MicroRNAs (miRNAs) are released into the bloodstream by all types of cells, either as cell-free molecules or inside of extracellular vesicles (EVs), such as exosomes. Exosomes play an important role in cell-to-cell communication by transferring a selection of miRNAs which then can influence the recipient cell. The use of disease-specific signatures of miRNAs in exosomes has become promising for clinical applications, either as biomarkers or direct therapeutic targets.
The most commonly used technique for exosome isolation is ultracentrifugation, but it is time-consuming and requires an expensive equipment. The second method of choice for exosomes separation is based on the precipitation with polyethylene glycol (PEG). Though this technique is fast, easy and non-laborious, it struggles with contaminations of plasma proteins and precipitation chemicals. For miRNAs isolation, most protocols are based on the use of hazardous chemicals, such as phenol/chloroform or guanidine thiocyanate for sample lysis. For these reasons, I developed a new method for the enrichment of exosomes with a subsequent miRNA extraction from different cell-free fluids (plasma, serum, urine and cell culture supernatant), followed by an improved RT-qPCR. For all developed methods, I examined numerous reagents and parameters as well as combinations thereof. For exosome extraction, I established a new method which is based on the mannuronate-guluronate polymer (MGP) technique which entraps exosomes, and so avoids the co-precipitation of plasma proteins providing vesicles of high purity. For miRNAs isolation, I applied a combination of chaotropic and non-chaotropic salts in low concentrations that are not hazardous to the health and environment and supported a fast and efficient extraction. For RT-qPCR, I optimized the chemistry and TaqMan probe of a previously published stem-loop primer-based protocol. Those modifications led to an improved efficiency of the miRNAs quantification method that is now faster and cheaper.
Quantity and integrity of exosomes isolated by my new MGP-based extraction method were determined by Western Blot, Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) and confocal microscopy. RNA extraction was verified by an Agilent Bioanalyzer and RT-qPCR. Sensitivity, efficiency, linearity, as well as repeatability and reproducibility of RT-qPCR were tested on serial dilutions of synthetic miR-16 and miR-142. These findings showed that my newly established procedure covering all steps of miRNA analyses measures the levels of either cell-free and exosomal miRNAs in plasma, serum and cell culture supernatant with high performance. In addition, I compared my approach with commercial techniques comprising PEG-based exosome precipitation, phenol/chloroform-based miRNA isolation and original stem-loop primer-based miRNA quantification. The MGP-based exosome separation method was much more efficient than the PEG-based kit to isolate polystyrene beads, commercial exosome standards and exosomes in a high purity and void of contaminated proteins from plasma and serum. The amplification of miR-16 and miR-142 with my optimized method resulted in a higher efficiency, repeatability and reproducibility than the commercial kit.
In summary, the application of the whole package of my newly established assays (exosome extraction, miRNA isolation and RT-qPCR) for miRNA measurements in exosomal and cell-free fractions showed that my method provided congruent data and was not influenced by the source (plasma or serum) used for the analysis, whereas the commercial assay delivered different data for plasma and serum. Moreover, my approach confirmed previous findings, that miR-16 circulates mostly as a cell-free form, while miR-142 is rather present in the exosomal fraction.

MikroRNAs (miRNAs) werden von allen Arten von Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt, entweder als zellfreie Moleküle oder innerhalb von extrazellulären Vesikeln (EVs), wie Exosomen. Exosomen spielen eine wichtige Rolle in der Zell-zu-Zell Kommunikation, indem sie eine Auswahl von miRNAs von Zelle zu Zelle transferieren, die dann die Empfängerzelle beeinflussen können. Die Verwendung krankheitsspezifischer Signaturen von miRNAs in Exosomen ist für klinische Anwendungen vielversprechend geworden, und zwar entweder als Biomarker oder direkte therapeutische Zielmoleküle. Die am häufigsten verwendete Technik für die Isolierung von Exosomen ist die Ultrazentrifugation, sie ist jedoch zeitaufwendig und erfordert eine teure Ausstattung. Die zweite Methode der Wahl für die Extraktion von Exosomen basiert auf der Präzipitation mit Polyethylenglykol (PEG). Obwohl diese Technik schnell, einfach und unkompliziert ist, hat sie mit Kontaminationen von Plasmaproteinen und Fällungschemikalien zu kämpfen. Die meisten Protokolle für die Isolierung von miRNAs basieren auf der Verwendung toxischer Chemikalien wie Phenol/Chloroform oder Guanidinthiocyanat für die Probenlyse. Aus diesen Gründen entwickelte ich eine neue Methode zur Anreicherung von Exosomen mit anschließender miRNA-Extraktion aus verschiedenen zellfreien Flüssigkeiten (Plasma, Serum, Urin und Zellüberstand), gefolgt von einer verbesserten RT-qPCR. Für alle entwickelten Methoden untersuchte ich zahlreiche Reagenzien und Parameter sowie Kombinationen davon. Für die Exosomenextraktion habe ich eine neue Methode entwickelt, die auf der Technik des Mannuronat-Guluronat-Polymers (MGP) basiert, bei der Exosomen eingeschlossen werden und so die gleichzeitige Ausfällung von Plasmaproteinen vermieden wird, wodurch Vesikel mit hoher Reinheit extrahiert werden. Für die Isolierung von miRNAs habe ich eine Kombination von chaotropen und nicht-chaotropen Salzen in geringen Konzentrationen angewendet, die nicht gesundheits- und umweltgefährdend sind und eine schnelle und effiziente Extraktion unterstützen. Für die RT-qPCR optimierte ich die Chemie und die TaqMan-Sonde eines zuvor veröffentlichten Stamm-Loop-Primer-basierten Protokolls. Diese Modifikationen führten zu einer verbesserten Effizienz der miRNA-Quantifizierungsmethode, die jetzt schneller und billiger ist. Menge und Integrität der mit meiner neuen MGP-basierten Extraktionsmethode isolierten Exosomen wurden durch Western Blot, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und konfokale Mikroskopie bestimmt. Die RNA-Extraktion wurde mit einem Agilent Bioanalyzer und RT-qPCR verifiziert. Empfindlichkeit, Effizienz, Linearität sowie Reproduzierbarkeit der RT-qPCR wurden an Serienverdünnungen von synthetischem miR-16 und miR-142 getestet. Diese Daten zeigten, dass mein neu etabliertes Verfahren, das alle Schritte der miRNA-Analyse abdeckt, mit hoher Performanz die Spiegel zellfreier und exosomaler miRNAs in Plasma, Serum und Zellüberstand misst. Darüber hinaus verglich ich meinen Ansatz mit kommerziellen Techniken, die die PEG-basierte Exosomenfällung, die Phenol/Chloroform-basierte miRNA-Isolierung und die ursprüngliche Stamm-Loop-Primer-basierte miRNA Quantifizierung umfassen. Das MGP-basierte Exosomen-Verfahren war viel effizienter als das PEG-basierte Kit, um Polystyrolkügelchen, kommerzielle Exosomenstandards und Exosomen in hoher Reinheit und ohne kontaminierte Plasmaproteine aus Plasma und Serum zu isolieren. Die Amplifikation von miR-16 und miR-142 mit meiner optimierten Methode führte zu einer höheren Effizienz, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit als das kommerzielle Kit.
Zusammenfassend zeigte die Anwendung des gesamten Pakets meiner neu etablierten Assays (Exosomenextraktion, miRNA-Isolierung und RT-qPCR) für miRNA-Messungen in exosomalen und zellfreien Fraktionen, dass meine Methode kongruente Daten lieferte und nicht von der Quelle (Plasma oder Serum) beeinflusst wurde, während der kommerzielle Assay unterschiedliche Daten für Plasma und Serum lieferte. Darüber hinaus bestätigte mein Ansatz frühere Erkenntnisse, dass miR-16 hauptsächlich als zellfreie Form zirkuliert, während miR-142 eher in der exosomalen Fraktion vorhanden ist.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6156
URN: urn:nbn:de:gbv:18-102262
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Schwarzenbach, Heidi (PD Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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