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Titel: The role of the NLRC4 inflammasome in the pathogenesis of coronary disease : The influence of genetic variations
Sonstige Titel: The role of the NLRC4 inflammasome in the pathogenesis of coronary disease : The influence of genetic variations
Sprache: Englisch
Autor*in: Zeller, Simon
Schlagwörter: Artherosklerose; angeborenes Immunsystem; Genom-weite Assoziations Studien; Interleukin 18; Artherosclerosis; Innate Immunity; Genome-Wide Association Studies; Interleukin 18
GND-Schlagwörter: Genetik; SNP; Gefäßkrankheit; Immunsystem
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-02-20
Zusammenfassung: 
Vorangegangene, populationsbasierte Studien identifizierten die Assoziation von spezifischen genetischen Polymorphismen (SNPs) innerhalb des NLRC4 Locus auf Chr. 2 und erhöhten IL-18-Plasmaspiegeln (NLRC4-Gen, Lead-SNP rs385076, pmeta = 2,4 * 10-45). Ein funktioneller Zusammenhang war naheliegend, in dem die SNPs die NLRC4-Proteinexpression beeinflussen. Eine Mehr-Aktivierung des pro-inflammatorischen NLRC4-Inflammasoms könnte zu einer erhöhten Prozessierung und Sekretion von IL-18 führen. Das pro-inflammatorische Zytokin IL-18 konnte bereits in vorangegangenen experimentellen und klinischen Studien funktionell mit vermehrter Arteriosklerose der Koronargefäße assoziiert, sowie als risikoprädiktiver Biomarker identifiziert werden (Mallat et al., 2001, Blankenberg et al., 2003). Diese Arbeit untersuchte den Zusammenhang zwischen den genetischen Polymorphismen SNP rs385076 (C/T; 2:32.264.782) und SNP rs479333 (G/C; 2: 32.264.089) innerhalb der 5'UTR des NLRC4 Locus (2:32.223.625 - 32.266.682, p22.3), und der NLRC4-Proteinexpression sowie klinischer Charakteristika innerhalb einer ausgewählten Studienkohorte. Ebenfalls wurde versucht, innerhalb der den SNPs naheliegende Abschnitten der NLRC4 5'UTR potentielle regulatorische Areale zu identifizieren.
Die NLRC4-Proteinexpression wurde in PBMC-Lysaten von sowohl gesunden sowie kardiovaskulär erkrankten Individuen mittels Western-Blot gemessen. Innerhalb eines HEK293A Zellkultur Modells wurde durch Luciferase Reportergen Assays die definierte NLRC4 5’UTR auf potentielle regulatorische Einheiten untersucht. Um die funktionelle Beziehung der SNPs mit der NLRC4 Expression detaillierter zu analysieren, wurde ein NLRC4-qPCR Modell in HEK293A-Zellen für Knockdown- und Überexpressions-Experimente innerhalb eines ersten Ansatzes versucht zu etablieren. In einer statistischen Aufarbeitung der untersuchten GHS Studienkohorte konnte das protektive SNP rs385076 Allel T mit signifikant niedrigeren mittleren CRP-Plasmaspiegeln assoziiert werden.
Es konnte gezeigt werden, dass SNP rs479333 Haplotypen eine grenzwertig signifikante Assoziation zu einer erhöhten NLRC4 Proteinexpression zeigen (*p = 0.049, SNP rs479333 Risiko allele G). Ein ähnlicher Zusammenhang wurde für SNP 385076 nicht gefunden. In Reportergen Assay Versuchen innerhalb dieser Studie konnte keine regulatorische Einheit auf der untersuchten NLRC4 5’UTR identifiziert werden. In folgenden Experimenten der Studiengruppe ließ sich jedoch im gleichen Versuchsmodell unter Zugabe des Transkriptionsfaktor PU.1 eine neue Transkriptionsfaktorbindungsstelle auf der um SNP 385076 auf der NLRC4 5’UTR identifizieren, sofern bei diesem das Risiko Allel C vorlag. Es zeigte sich hierbei eine signifikant erhöhte Aktivität der Luciferase sowie NLRC4 Expression verschiedener NLRC4 Isoformen in Luciferase Reportergen Assays bzw. qPCR Experimenten.
Die Bedeutung des NLRC4 Locus innerhalb der immunologischen Pathogenese von Arteriosklerose, und damit der kardiovaskulären Mortalität konnte in dieser Studie weiterführend gezeigt werden. Auch wenn die genauen molekularen Mechanismen weiterhin unklar sind, weisen die Ergebnisse auf die Relevanz von beispielsweise nichtkodierender RNA in der Regulation des Immunsystems hin.

Prior large-scaled, population-based studies identified the association of specific polymorphisms (SNPs) and increased IL-18 plasma levels, indicating a genetic locus with a potentially functional association (NLRC4 gene, lead SNP rs385076, pmeta = 2.4 * 10-45). It was suggested, that the SNPs may influence the NLRC4 protein expression and subsequent activation of pro-inflammatory NLRC4-inflammasome, leading to increased maturation of IL-18. The pro-inflammatory IL-18 was functionally linked to CAD development as well as utilized as a risk-predictive biomarker (Mallat et al., 2001, Blankenberg et al., 2003). This thesis examined the relation between genetic variants SNP rs385076 (C/T; 2:32.264.782) and rs479333 (G/C; 2:32.264.089) within the 5’UTR of the NLRC4 locus (2:32.223.625 to 32.266.682, p22.3) and NLRC4 protein expression as well as clinical characteristics within a selected study-cohort of the GHS. Also, novel regulatory sites within the respective 5’UTR were tried to be identified.
NLRC4 protein expression was measured by western blot analysis in PBMC lysates of both, healthy individuals and those with CAD. The identification of putative regulatory sites within NLRC4 5’UTR in proximity to SNPs rs385076 and rs479333 was tried to be performed utilizing a luciferase reporter gene assays in a HEK293A cell model. In an approach to further investigate the functional relation between respective SNPs and NLRC4 expression, an NLCR4 qPCR model in HEK293A cells was tried to be established. Within the examined study cohort, SNP rs385076 protective allele T was associated with significantly lower mean CRP plasma levels in comparison to its risk allele C.
In conclusion, SNP rs385076 haplotypes did not show an association with NLRC4 protein expression, whereas SNP rs479333 showed an association with borderline significance (p = 0.049). Within the NLRC4 5’UTR, no putative regulatory sites could be identified using luciferase reporter gene assays. Still, the following investigators were able to identify a novel transcriptional factor binding site for transcriptional factor PU.1, if rs385076 risk-allele C is present. When incubating cells with PU.1, a significantly increases luciferase activity, as well as increased NLRC4 expression of NLRC4 isoforms, were observed in luciferase reporter gene assays and qPCR experiments.
The findings highlight the importance of the NLRC4 gene locus on immunological aspects of CAD development and subsequently, cardiovascular mortality. Further experimental studies may address novel regulatory pathways, i.e. the influence of non-coding RNA.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6219
URN: urn:nbn:de:gbv:18-103258
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Zeller, Tanja (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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