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Titel: Expression, purification and structural analysis of key components of the Shigella T3SS basal body in two states
Sonstige Titel: Expression, Aufreinigung und Strukturanalyse von Hauptkomponenten des Shigella T3SS Basalkörpers in zwei unterschiedlichen Zuständen
Sprache: Englisch
Autor*in: Kamprad, Antje
GND-Schlagwörter: Shigella; Elektronenmikroskopie; Strukturanalyse; Ortspezifische Mutagenese; Fluoreszenzmikroskopie; Membranproteine
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-03-06
Zusammenfassung: 
Shigella flexneri is a gram-negative bacterium that infects the human intestine, using the type three secretion system. Type three secretion systems (T3SS) are membrane-embedded transporters essential for the survival of gram-negative pathogens in the hosts and a continual infection. The T3SS enables Shigella delivery of effector proteins directly to the host cell cytosol, promoting the infection process. A prominent feature of the T3SS is the basal body, consisting of an inner and outer membrane ring,
encompassing a central needle and a rod.

In this study I will discuss the structure of the periplasmic inner membrane ring (IM ring) and the connector of the Shigella T3SS, in the apo state and in the light of effector transport. Three proteins, MxiG, MxiJ and MxiD, constitute the inner membrane ring and the connector their architecture was not known to-date. To analyze the structure of the T3SS upon effector transport, T3SS trapped with an effector fusion protein were used. The IM ring and the connector derive from cryo-electron microscopy maps and could be solved at resolutions of at 3.6 Å and 3.9 Å for the apo structure, and 4.0 Å and 4.2 Å
trapped with an effector, respectively.
The inner membrane ring adopts a 24-fold rotational symmetry and shows an extensive polar channel system connecting the bacterial periplasm with the cytosol. A conserved area in MxiG is essential for effector secretion, needle complex stability and invasiveness, as proven by site-directed mutagenesis in combination with biological and biochemical assays.
The inner membrane ring and the outer membrane ring are connected by β-sheet augmentation, which could be shown for the first time in Shigella. The connector adopts a 16-fold symmetry while the outer membrane ring adopts a 15-fold symmetry. Apparently, the protein backbone of the inner membrane ring and the connector are very similar in the apo and effector trapped state.

Shigella flexneri ist ein gram-negatives Bakterium, welches den menschlichen Darm mit Hilfe des Typ-3-Sekretionssystems (T3SS) infiziert. Das T3SS ist ein Transmembrantransporter und für eine erfolgreiche Infektion notwendig. Ein hervorstechendes Merkmal des T3SS ist der Basalkörper, bestehend aus einem inneren und äußeren Membranring, welche eine Nadel-artige Struktur die mit einen kurzen Hohlzylinder, dem inner rod, verbunden ist umschließen.

In dieser Studie werden die Struktur des periplasmatischen Innermembranringes und des Konnektors des Shigella T3SS, in Abwesenheit von Effektoren (Apo) und mit einem Effektor im T3SS untersucht. Drei Proteine, MxiG, MxiJ und MxiD, bilden den Innermembranring (MxiG und MxiJ) und den Konnektor (MxiD) und ihr Aufbau war bis jetzt unbekannt. Um die Struktur des T3SS während des Effektortransportes zu analysieren, wurde ein Effektorfusionsprotein benutzt. Die Struktur des Innermembranrings und des Konnektors basieren auf Kryoelektronenmikoskopiedaten und konnten jeweils bis zu einer Auflösung von 3.6 Å und 3.9 Å für das Apo T3SS und 4.0 Å und 4.2 Å für das T3SS mit einem Effektor gelöst werden. Der Innermembranring fällt durch einen symmetrischen Aufbau von jeweils 24 Untereinheiten von MxiG und MxiJ auf. Kanäle mit einem negativen elektrostatischen Potential durchziehen den Innermembranring und verbinden das Periplasma mit dem bakteriellen Zytosol. Eine sequenzkonservierte Region in MxiG konnte identifiziert werden, welche für die Effektorsekretion, die strukturelle Integrität des Nadelkomplexes und die Wirtszellinvasivität eine wichtige Rolle spielt. Hierfür wurden Ein-Punkt-Mutationen durchgeführt und mittels biologischer und biochemischer Assays analysiert.
Die Verbindung zwischen dem Innermembranring und dem Ring des T3SS, welcher sich an der äußeren Membran anlagert, konnte für Shigella zum ersten Mal gezeigt werden. Der Konnektor ist ein symmetrischer Ring aus 16 MxiD Untereinheiten, während der Rest des äußeren Membranringes durch eine 15-fache Symmetrie gekennzeichnet ist. Die C-alpha positionen von Apo und Effektorgeladem T3SS in Konnektor und der Region des Innermembranringes sind sich sehr ähnlich.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6249
URN: urn:nbn:de:gbv:18-103795
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Kolbe, Michael (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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