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Titel: Investigation of the autophagy-lysosomal pathway in human inherited cardiomyopathies
Sonstige Titel: Untersuchung des Autophagie-lysosomalen Signalweges in humanen vererbbaren Kardiomyopathien
Sprache: Englisch
Autor*in: Zech, Antonia Theresa Luisa
Schlagwörter: Autophagie; humane vererbbare Kardiomyopathien; autophagische Aktivität; humane induzierte pluripotente Stammzellen-abgeleitete Kardiomyozyten; Autophagy; human inherited cardiomyopathies; autophagic flux; human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-05-05
Zusammenfassung: 
The autophagy-lysosomal pathway (ALP) maintains cellular homeostasis by degrading long-lived proteins and organelles. Hypertrophic (HCM) and dilated cardiomyopathy (DCM) are the two most common human inherited cardiomyopathies and MYBPC3, encoding the cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C), is the most frequently mutated gene in HCM. However, it remains elusive how an (altered) ALP and MYBPC3 mutations effectively contribute to the pathogenesis of HCM and DCM. Therefore, myocardial tissue samples of HCM and DCM patients, as well as 2D cultured human induced-pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) of an HCM patient and a DCM patient were evaluated for a putatively altered ALP. Besides, homozygous, compound heterozygous and heterozygous MYBPC3-deficient human cellular models of HCM were generated and characterized as hiPSC and hiPSC-CMs.
The ALP evaluation in cardiac tissues samples showed lower levels of LAMP-2 in HCM, but higher levels of LAMP-2 in DCM that were also present in DCM hiPSC-CMs by tendency. Further, a higher autophagic activity was detected in HCM hiPSC-CMs, whereas DCM hiPSC-CMs showed a lower autophagic activity than the corresponding isogenic controls. Protein expression changes observed in mass spectrometry of samples treated with an ALP inhibitor however seemed to correlate more with batch-to-batch variability and/or genetic background than with the treatment. Although, a batch-to-batch variability was also detected by immunoblotting, the differences were not as prominent as the ALP-inhibition-induced increase in LC3-II. Despite this, an increase of p62 after ALP inhibition was detected in all hiPSC-CMs by mass spectrometry and immunofluorescence. In all HCM hiPSC-CMs a striated pattern of p62 aggregates was detected by immunofluorescence staining, suggesting a higher ALP activity along sarcomeres, t-tubules or the sarcoplasmic reticulum.
Concurrently, the MYBPC3-deficient hiPSC clones, generated by CRISPR, were differentiated into hiPSC-CMs of high purity, although a trisomy of chromosome 1 was detected in all of them. mRNA analysis revealed alternative splicing, resulting in multiple forms of mRNA, whereby the reading frame of the compound heterozygous clone was restored on one allele and nearly full-length cMyBP-C was detected. For the homozygous clone, full-length cMyBP-C was not detected. Further, truncated cMyBP-C was not detected in all CRISPR clones, although MYBPC3 mRNA was still present in lower amounts. Cell area analysis at day 30 of culture indicated hypertrophy in all CRISPR clones. Thus, the generated HCM model might be a suitable in vitro tool, but further experiments are needed.
Finally, it remains unclear how the altered ALP and MYBPC3 mutations affect HCM and DCM. However, the ALP is vital for the heart during disease, as it prevents the accumulation of toxic proteins and a defect of the ALP in human inherited cardiomyopathy has been shown. Also, the role of MYBPC3 within HCM has been deeply investigated. But it remains unclear how a mutation in MYBPC3 and the involvement of the ALP ultimately lead to HCM or DCM pathomechanism. Thus, there is a great need for research that ultimately aims to unravel novel therapeutic options for human inherited cardiomyopathies.

Der Autophagie-lysosomale Signalweg (ALP) ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Homöostase, da er langlebige Proteine und Organellen abbaut. Hypertrophe (HCM) und dilatative Kardiomyopathie (DCM) sind die zwei am häufigsten vorkommenden humanen vererbbaren Kardiomyopathien und MYBPC3, welches das kardiale Myosin-bindende Protein-C (cMyBP-C) kodiert, ist das am häufigsten mutierte Gen in HCM. Jedoch ist es bis heute ungeklärt, wie ein (veränderter) ALP und Mutationen in MYBPC3 effektiv an der Pathogenese von HCM und DCM beteiligt sind. Deswegen wurden myokardiale Gewebsproben von HCM und DCM Patienten, sowie Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen von einem HCM Patienten und einem DCM Patienten (hiPSC-CMs) differenziert wurden, auf eine mögliche Veränderung des ALPs untersucht. Zudem wurden homozygote, gemischt heterozygote und heterozygote MYBPC3-defiziente, humane zelluläre HCM Modelle generiert und auf Stammzell- und Kardiomyozytenebene näher charakterisiert.
Die Untersuchung des ALPs in humanem kardialem Gewebe zeigte einen niedrigeren Proteinspiegel von LAMP-2 in HCM aber einen höheren Proteinspiegel in DCM, welcher auch tendenziell in DCM hiPSC-CMs präsent war. Zudem wurde eine gesteigerte autophagische Aktivität in HCM, aber eine verringerte autophagische Aktivität in DCM hiPSC-CMs im Vergleich zu den zugehörigen isogenen Kontrollen gezeigt. Die massenspektrometrische Analyse von ALP-Inhibitor-behandelten Proben zeigte, dass die Batch-zu-Batch Variabilität und/oder der genetische Hintergrund stärker mit der Veränderung der Proteinexpression in den behandelten Proben zu korrelieren scheint als mit der Behandlung. Obwohl eine Batch-zu-Batch Variabilität auch im Immunoblot bestand, war diese nicht stärker als der Anstieg in LC3-II nach ALP-Inhibierung. Jedoch zeigten die massenspektrometrische Untersuchung und die Immunfluoreszenzfärbung einen Anstieg der p62 Proteinmenge nach ALP-Inhibierung, unabhängig von der beobachteten Variabilität. Zudem zeigten die Immunfluoreszenzfärbungen aller HCM hiPSC-CMs eine deutliche Akkumulierung von p62 in einem quergestreiften Muster, welches eine höhere ALP-Aktivität an den Sarkomeren, den T-Tubuli oder dem Sarkoplasmatischen Retikulum andeutet.
Zeitgleich wurden mittels CRISPR generierte MYBPC3-defiziente hiPSC Klone mit hoher Effizienz zu hiPSC-CMs differenziert, obwohl eine Trisomie von Chromosom 1 in allen geCRISPRten Klonen vorlag. Diese zeigten zahlreiche mRNA Variationen von MYBPC3, die unter anderem durch alternatives Spleißen entstanden waren. Dies war nur problematisch für den gemischt heterozygoten Klon, da hier das Leseraster wiederhergestellt wurde und ein cMyBP-C in fast voller Länge detektiert wurde. Für den homozygoten Klon wurde cMyBP-C nicht in voller Länge detektiert. Zudem wurde in keinem der geCRISPRerten Klone trunkiertes cMyBP-C gefunden, obwohl entsprechende MYBPC3 mRNA in reduzierter Menge vorhanden war. Messungen der Zellfläche nach 30 Tagen Kultivierung deuteten auf eine Hypertrophie hin, ein Kennzeichen von HCM. Aus den Daten lässt sich schließen, dass das hier generierte humane HCM Modell geeignet scheint, HCM in vitro zu untersuchen, wobei jedoch weitere Experimente nötig sind.
Abschließend lässt sich sagen, dass unklar bleibt, wie der veränderte ALP und MYBPC3 Mutationen HCM und DCM beeinträchtigen. Nichtdestotrotz ist der ALP essentiell für das Herz während einer Erkrankung, da er die Akkumulierung von toxischen Proteinen verhindert und eine Beeinträchtigung des ALPs in humanen vererbbaren Kardiomyopathien gezeigt wurde. Auch die Rolle von MYBPC3 in HCM wurde schon ausführlich untersucht. Jedoch, bleibt unklar, wie eine Mutation in MYBPC3 und die Beteiligung des ALPs schließlich zu den Pathomechanismen von HCM und DCM führen. Folglich gibt es einen großen Forschungsbedarf, um neue therapeutische Optionen für humane vererbbare Kardiomyopathien zu entwickeln.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6266
URN: urn:nbn:de:gbv:18-104351
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Oetjen, Elke (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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