Einfluss eines dysfunktionalen UCH-L1-Enzyms auf die podozytäre Proteostase in der Membranösen Nephropathie

Abstract

Die Membranöse Nephropathie (MN) ist die häufigste Ursache für ein nephrotisches Syndrom im Erwachsenenalter und wird durch die Bindung von zirkulierenden Autoantikörpern an podozytenspezifische Antigene ausgelöst. Dabei wird ein von erhöhtem oxidativen Stress begleiteter entzündlicher Prozess induziert, der zu einem Struktur- und Funktionsverlust der Podozyten führt. Neue Studien demonstrieren eine zunehmende Bedeutung von proteinabbauenden Systemen wie dem Ubiquitin Proteasomalen System (UPS) in geschädigten Podozyten. In der MN weisen Podozyten trotz Hochregulation des UPS eine gestörte Proteinhomöostase auf, die sich in einer beeinträchtigten proteasomalen Aktivität und einer krankhaften Akkumulation geschädigter Proteine widerspiegelt. Dabei wird im erkrankten Podozyten vor allem die UPS-Komponente Ubiquitin C-terminale Hydrolase-L1 (UCH-L1) am stärksten de novo exprimiert. In Neuronen ist UCH-L1 ein essenzieller Regulator des Monoubiquitinpools. Die Rolle von UCH-L1 beim Podozytenschaden ist bisher ungeklärt. In einem etablierten Mausmodell der MN wurde gezeigt, dass das Fehlen von UCH-L1 im Podozyten eine protektive Wirkung auf die Podozytenintegrität hat und einer Akkumulation von polyubiquitinierten Proteinen entgegenwirkt (unveröffentlicht). Diese Daten implizieren, dass die UCH-L1-Aktivität den Schaden im erkrankten Podozyten aufrechterhält bzw. fördert. Die in neurodegenerativen Erkrankungen beschriebenen UCH-L1-Fehlfunktionen beruhen auf einer Punktmutation im katalytischen Zentrum (I93M) oder auf oxidativer Modifikation des Enzyms und sind, wie in der MN, durch einen akkumulativen Phänotyp gekennzeichnet. Es wurde gezeigt, dass oxidativ-geschädigte UCH-L1 vergleichbare strukturelle und biochemische Eigenschaften wie die Parkinson-assoziierte I93M-Mutation besitzt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte mit Hilfe grundlegender Charakterisierungsexperimente und mechanistischer Studien sowohl im naiven Tier als auch im Mausmodell der MN geklärt werden, inwiefern eine durch oxidativen Stress bedingte strukturelle und funktionelle Veränderung von UCH-L1 1) den Podozytenschaden im Vergleich zum Wildtypprotein begünstigt und 2) welche direkten oder indirekten Interaktionen dieses entstandene aberrante Protein eingeht. Zu diesem Zweck wurden erstmalig zwei Mauslinien generiert, die podozytenspezifisch das UCH-L1-Wildtypprotein bzw. oxidativ-modifizierte UCH-L1 (repräsentiert durch Einbringen der dysfunktionalen I93M-Mutation) überexprimieren. Proteinbiochemische und mikroskopische Untersuchungen demonstrieren, dass die Überexpression des Wildtyp-UCH-L1-Enzyms als auch des dysfunktionalen UCH-L1-I93M-Enzyms in naiven Podozyten keine Stressantwort auslöst. Trotzdem weisen die Tiere mit dem überexprimierten UCH-L1-WT-Protein eine Proteinurie auf, die nicht auf einem Podozytenverlust beruht, sondern vielmehr auf veränderte Expressionslevel podozytenspezifischer Proteine wie Nephrin und α-Aktinin-4 zurückzuführen ist, die für die Aufrechterhaltung der glomerulären Filtrationsbarriere essenziell sind. Im Gegensatz dazu zeigen Mäuse mit einer podozytenspezifischen Überexpression von UCH-L1-I93M keine Proteinurie und keine veränderte Podozytenintegrität. Dennoch wirkt sich die Hochregulation von UCH-L1-I93M negativ auf die Proteinhomöostase im Podozyten aus, da trotz verstärkter Expression der katalytisch wirksamen Beta-5-Untereinheit die proteasomale Aktivität beeinträchtigt ist und der Abbau akkumulierter polyubiquitinierter Proteine nicht bewältigt werden kann. Diese Tiere weisen eine kompensatorische Induktion des lysosomalen Abbauweges auf. Immunopräzipitations- und proteasomale Aktivitätsexperimente zeigen, dass UCH-L1 an das Standardproteasom bindet, wobei nur die dysfunktionale UCH-L1-I93M-Form die proteasomale Aktivität herabsetzt. Untersuchungen im Mausmodell der MN verweisen ebenfalls darauf, dass nur die UCH-L1-I93M-Variante den für die MN typischen akkumulativen Phänotyp hervorruft, der mit einem starken Podozyten- und Strukturverlust sowie einer schweren Proteinurie einhergeht. Diese Ergebnisse decken sich mit den in Patientenseren identifizierten Autoantikörpern gegen UCH-L1, die vor allem das dysfunktionale Protein mit einer hohen Affinität binden. In dieser Arbeit konnte ein möglicher Mechanismus aufgezeigt werden, wie UCH-L1 eine Dysregulation des UPS im gesunden und erkrankten Podozyten hervorruft und sekundär den Podozytenschaden begünstigt. Zusammen mit den nachgewiesenen Patienten-Autoantikörpern identifizieren diese Erkenntnisse das dysfunktionale UCH-L1-Enzym als potenziellen Progressionsmarker in der MN.

Membranous nephropathy (MN) is the most frequent cause of nephrotic syndrome in adults and is induced by binding of circulating autoantibodies to antigens expressed by podocyte foot processes. This autoantibody/antigen reaction results in an enhanced oxidative stress, which induces loss of podocyte structure and function. Recent studies demonstrate an involvement of protein degradation systems such as the ubiquitin proteasomal system (UPS) in podocyte injury. Even though podocytes exhibit a marked induction of the UPS in MN their proteostasis is altered, a condition reflected by a reduced proteasomal activity and by an accumulation of damaged proteins. Among the strongest de novo induced UPS proteins is the neuronal Ubiquitin C-terminal Hydrolase-L1 (UCH-L1). In neurons, UCH-L1 represents an essential regulator of the intracellular pool of monoubiquitin. The role of UCH-L1 in podocyte injury is not known. Unpublished data of our group demonstrate that podocyte-specific deletion of UCH-L1 exerts a protective effect on podocyte integrity in an established murine model of MN and prevents an accumulation of polyubiquitinated proteins. These findings suggest that UCH-L1 activity maintains or perpetuates podocyte injury. In neurodegenerative disease, UCH-L1 malfunctions, which depend on a point mutation (I93M) within the catalytic center or on an oxidative modification of the enzyme, have been described and result in an accumulative phenotype. Interestingly, oxidative-modified UCH-L1 exhibits comparable structural and biochemical alterations to the Parkinson-associated I93M mutation. Which mechanistic factor(s) contribute to the accumulative phenotype in UCH-L1 malfunction is unknown. Aim of the current project was to perform phenotypic and mechanistic analyses of transgenic mice overexpressing the wildtype or the I93M mutated UCH-L1 in podocytes in the naive condition and following induction of MN, and to assess in what way oxidative stress induced structural and functional alterations of UCH-L1 affect podocyte injury, and which direct or indirect interactions are engaged by this aberrant protein. Proteinbiochemical and microscopic evaluations demonstrate that both overexpression of wildtype and of I93M mutated UCH-L1 do not per se induce a severe stress response. Mice that overexpress the UCH-L1-WT protein in podocytes develop proteinuria, which does not result from podocyte loss but rather from an altered expression of podocyte-specific proteins such as nephrin and α-actinin-4, which are essential for the maintenance of the glomerular filtration barrier. Contrastingly, mice that overexpress UCH-L1-I93M in podocytes exhibit disturbances in their proteostasis, however no proteinuria. Specifically, despite enhanced levels of the beta-5 subunit of the proteasome, proteasomal activity is reduced and polyubiquitinated proteins accumulate. These mice exhibit a compensatory induction of the lysosomal degradation pathway. Immunoprecipitation and proteasomal activity assays demonstrate that UCH-L1 binds to the standard proteasome, whereby only binding of UCH-L1-I93M results in a decrease of proteasomal activity. Investigations in the murine model of MN demonstrate that only UCH-L1-I93M induces the for MN typical protein accumulations, which is accompanied by a severe podocyte loss and morphological alteration of the glomerular filtration barrier resulting in nephrotic range proteinuria. These results are mirrored by the finding in patient sera, in which we identified autoantibodies against UCH-L1 with a preferential affinity to the dysfunctional enzyme. In summary we propose a mechanism by which UCH-L1 induces a dysregulation of the UPS in naive and injured podocytes that perpetuates injury. In conjunction with the discovered patient antibodies these findings identify dysfunctional UCH-L1 as a potential marker for progressive podocyte injury in MN.