Characterization of the Merkel cell polyomavirus encoded miRNA mcv-miR-M1

Abstract

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) persists asymptomatically in the majority of the healthy human population and is considered the etiological agent in the majority of Merkel cell carcinoma (MCC) cases, a rare but highly aggressive skin cancer. Due to the lack of appropriate model systems, the natural biology of the virus, including the mechanisms that lead to the establishment and maintenance of lifelong persistence, are only poorly understood. MCPyV belongs to a subgroup of polyomaviruses that express microRNAs (miRNAs). miRNAs are small non-coding RNAs produced by eukaryotes and certain viruses to post transcriptionally regulate gene expression. Viral miRNAs can target different viral and cellular mRNAs and are often associated with regulation of the host’s immune response and maintenance of viral persistence. Due to its perfect complementarity to mRNAs encoding for viral Tumor-Antigens (T-Ag), the MCPyV miRNA mcv-miR-M1 has the potential to downregulate T-Ag expression. However, if and how mcv-miR-M1 influences the viral life cycle remains elusive. The aim of this work was to elucidate the role of mcv-miR-M1 during viral replication using a recently developed semi-permissive MCPyV model system with a synthetic, replication-competent MCPyV genome (MCVSyn). Using this system, the present study provides the first comprehensive transcriptional analysis of authentically replicating MCVSyn and provides evidence for the involvement of a polyomavirus miRNA in viral persistence. Analysis of a mutant virus which is deficient for mcv-miR-M1 expression revealed that mcv-miR-M1 causes a reduction in viral genome replication via downregulation of LT-Ag expression. ChIP-Seq and RNA-Seq analyses of replicating MCVSyn indicated that, in addition to mechanisms that depend on inefficient termination of late strand transcription, mcv-miR-M1 can also be expressed independently from NCCR-initiated transcription from an autonomous RNA-pol II promoter that is embedded within the early coding region. Unexpectedly, MCVSyn was found to establish episomal persistence in a small subset of cells for several months, providing the unique opportunity to study the role of mcv-miR-M1 in viral persistence. Strikingly, in the absence of mcv-miR-M1 expression, MCVSyn was severely limited in its ability to persist over long periods of time, suggesting that mcv-miR-M1 is an essential factor for the maintenance of persistence. The observation that LT-Ag negatively affects cellular proliferation, but is required for maintenance of viral replication suggests a model in which mcv-miR-M1 plays an important role for the successful maintenance of persistence of viral episomes via balancing LT-Ag expression levels to allow viral DNA replication while minimizing detrimental effects on host cell survival. This study represents the first comprehensive transcriptomic analysis of a replicating human polyomavirus and by characterizing the role of the viral miRNA in short-term and long-term replication significantly contributes to our understanding of viral miRNAs and their importance for viral persistence.

Das humane Tumorvirus Merkelzellpolyomavirus (MCPyV) persistiert asymptomatisch im überwiegenden Teil der erwachsenen Bevölkerung und ist die Hauptursache der Entstehung von Merkelzellkarzinomen (MCC), einer seltenen aber höchst aggressiven Form von Hautkrebs. Der Lebenszyklus von MCPyV, inklusive der Mechanismen, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der Persistenz ermöglichen, ist aufgrund fehlender Modellsysteme bislang kaum erforscht. Einige Polyomaviren, darunter MCPyV, exprimieren microRNAs (miRNAs), kurze, nicht-kodierende RNAs, die in Eukaryoten und einigen Viren die Genexpression auf mRNA-Ebene regulieren können. Virale miRNAs können sowohl die virale als auch die zelluläre Genexpression beeinflussen und dabei unter anderem eine Rolle in der Etablierung viraler Persistenz spielen. Die MCPyV miRNA mcv-miR-M1 besitzt perfekte Komplementarität zu den frühen viralen Transkripten und hat daher das Potential die Expression der Tumor-Antigene (T-Ag) zu verringern. Ob mcv-mir-M1 jedoch tatsächlich die Expression der T-Antigene während der viralen Replikation reguliert und ob dies den viralen Lebenszyklus beeinflusst, ist bislang nicht untersucht worden. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, die Rolle von mcv-miR-M1 während der viralen Replikation aufzuklären. Dazu wurde ein synthetisches MCPyV-Genom verwendet, MCVSyn, das in einem kürzlich etablierten semi-permissives Replikationssystem authentisch repliziert. Mit Hilfe dieses Systems wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal eine umfassende Charakterisierung des MCPyV Transkriptoms durchgeführt. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden, dass eine Polyomavirus kodierte miRNA die Etablierung viraler Persistenz beeinflusst. Die Charakterisierung einer MCVSyn-Mutante, die keine reife miRNA produzieren kann zeigte, dass mcv-miR-M1 die Expression der T-Antigene verringert und dadurch einen negativen Effekt auf die Virusreplikation besitzt. In RNA-Seq und ChIP-Seq Analysen konnte beobachtet werden, dass mcv-miR-M1 nicht nur aus späten Transkripten, die in der NCCR initiiert werden und über das gesamte virale Genom fortlaufen, prozessiert werden kann, sondern auch in Abwesenheit von NCCR-abhängiger Transkription von einem eigenen RNA-pol II abhängigen Promoter. Im Laufe dieser Arbeit wurde die unerwartete Beobachtung gemacht, dass MCVSyn für einige Monate in wenigen Zellen persistieren kann, was die bisher einzigartige Möglichkeit eröffnet, den Einfluss einer Polyomavirus kodierten miRNA auf die virale Persistenz zu untersuchen. Interessanterweise stellte sich dabei heraus, dass die Anwesenheit von mcv-miR-M1 essentiell für die Persistenz viraler Episome ist. Die Beobachtung, dass LT-Ag die zelluläre Proliferation negativ beeinflusst, jedoch unabdingbar für die Virusreplikation ist, impliziert ein Model, in dem ein Minimum von LT-Ag für die Aufrechterhaltung viraler Persistenz benötigt wird, jedoch zu hohe LT-Ag Level einen negativen Effekt auf das Überleben persistent infizierter Zellen besitzen. Die Fähigkeit der viralen miRNA die LT-Ag Expression zu balancieren, ist in diesem Szenario daher ein entscheidender Faktor für die Etablierung und Aufrechterhaltung viraler Persistenz. Mit diesen Ergebnissen trägt die vorliegende Arbeit maßgeblich zum Verständnis der Funktionen viraler miRNAs bei und bestätigt die bisherigen Vermutungen, dass Polyomavirus kodierte miRNAs eine Rolle in viraler Persistenz spielen können.