Das TriPPPro-Konzept : Entwicklung und Charakterisierung von antiviralen Nukleosidtriphosphat-Prodrugs

Abstract

Seit Jahrzehnten finden zahlreiche Analoga natürlicher Nukleoside in der onkologischen und antiviralen Therapie Anwendung und nehmen heutzutage insbesondere bei der Behandlung von HIV, Herpes, Hepatitis B und Hepatitits C eine Schlüsselrolle ein. Allerdings verläuft die Biotransformation in die biologisch aktive Triphosphatform aufgrund der hohen Substrat-spezifität der beteiligten zellulären Enzyme meist sehr ineffizient. Der Verlust der therapeutischen Aktivität muss durch eine hohe Dosierung des Medikaments ausgeglichen werden, die teilweise schwerwiegende Nebenwirkungen zur Folge haben kann. Eine Möglichkeit, die Effizienz der Nukleosidanaloga zu erhöhen, stellt die Verabreichung von bioreversibel maskierten, phosphorylierten Wirkstoffen, sogenannten Prodrugs, dar. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung des TriPPPro-Konzepts als erster vielversprechender Ansatz zur Maskierung von Nukleosidtriphosphat (NTP)-Prodrugs. Um die generelle Anwendbarkeit des Konzepts zu unterstreichen, wurden Triphosphat-Prodrugs sowohl mit unterschiedlichen Maskierungs- als auch Nukleosidstrukturen synthetisiert und hinsichtlich ihres chemischen sowie enzymatischen Hydrolyseverhaltens charakterisiert. Eine Serie von Nukleosidtriphosphat-Prodrugs auf Basis des Anti-HIV-Wirkstoffs d4T variierte dabei in der Länge und Modifikation der als Maskierungseinheiten verwendeten Acylreste, um die Auswirkungen auf die Zellpermeabilität zu untersuchen. Die Darstellung erfolgte über eine für DiPPro-Nukleosiddiphosphat (NDP)-Prodrugs konzipierte konvergente Syntheseroute. Da die Gewinnung des nach diesem Protokoll notwendigen NDPs mit niedrigen Ausbeuten einherging sowie sehr zeitintensiv war, wurde eine alternative Synthesemöglichkeit entwickelt. Nach dieser konnte ausgehend von dem leichter zugänglichen Nukleosidmonophosphat (NMP) eine Vielzahl von TriPPPro-Verbindungen synthetisiert werden, deren Nukleoside sich sowohl am Glykon als auch an der Nukleobase in der Art der Modifikation unterschieden. Bei Hydrolyseuntersuchungen in Phosphatpuffer (PBS, pH 7.3) wurde nachgewiesen, dass die Nukleosidtriphosphate überwiegend den dominierenden Metaboliten darstellen. Die konkurrierende Hydrolyse der Phosphoranhydridbindung zwischen dem beta- und gamma-Phosphat führte jedoch mit einer zunehmenden Hydrolysehalbwertszeit des Prodrugs zu einer ansteigenden Bildung von NDP. Die enzymatische Aktivierung mit isolierter Schweineleberesterase (PLE) erlaubte eine schnelle und selektive Freisetzung des NTPs, wie mithilfe von Primer-Extension-Assays sowie Polymerasekettenreaktionen bewiesen werden konnte. Bei der enzymatischen Spaltung in CEM-Zellextrakten war eine kontinuierliche Abhängigkeit der Hydrolysehalbwertszeiten von der Kettenlänge festzustellen. Allerdings lagen die Halbwerts-zeiten signifikant niedriger als in PBS. Gleichzeitig konnte in den Zellextrakten die Freisetzung von NTP aus TriPPPro-NTP-Prodrugs bestätigt werden, obgleich die zellulären Enzyme einen schnellen Abbau zu den jeweiligen NDP bewirkten. Erwartungsgemäß korrelierte die antivirale Aktivität gegen HIV-1 und HIV-2 mit der Lipophilie der TriPPPro-d4TTP-Prodrugs. Durch eine intrazelluläre Freisetzung der höher phosphorylierten Metabolite konnten EC50-Werte erreicht werden, die von einer bis zu dreimal höheren Aktivität gegen HIV-1 und HIV-2 als d4T zeugten. Ebenso war eine Abhängigkeit der antiviralen Aktivität von der Lipophilie der TriPPPro-Verbindungen in TK-defizienten Zellen festzustellen, in denen d4T keine antivirale Wirkung besitzt. Mit zunehmender Lipophilie zeigten die Prodrugs eine verbesserte antivirale Aktivität. In einer Zellaufnahmestudie mit einem fluoreszierenden Prodrug konnte die erfolgreiche intrazelluläre Freisetzung des biologisch aktiven Triphosphatmetaboliten belegt werden. Die Prodrugs weiterer Nukleosidanaloga offenbarten im Vergleich zum Nukleosid signifikante Verbesserungen der Anti-HIV-Aktivität. So konnte die Aktivität von Nukleosiden durch Anwendung des TriPPPro-Konzepts um das bis zu 21-Fache gesteigert werden. Es gelang sogar, inaktive Nukleoside in hochaktive Wirkstoffe gegenüber HIV-1 umzuwandeln. Demzufolge wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Synthese unterschiedlich modifzierter NTP-Prodrugs die generelle Anwendbarkeit des TriPPPro-Konzepts bestätigt. Diese Methodik könnte einen Durchbruch in der Prodrugentwicklung darstellen, da sie die biologische Aktivität der heutigen sowie zukünftigen Nukleoside erhöhen und somit zu einer Verbesserung der antitumoralen und antiviralen Therapie beitragen kann.

Over the last decades a variety of nucleoside analogues were widely applied in antitumor and antiviral therapy. Moreover, they build the backbone for treatment of HIV, herpesvirus, hepatitis B and hepatitis C virus infections nowadays. However, the therapeutic activity of these compounds is often limited by an ineffective stepwise phosphorylation to the pharmaceutical active nucleoside triphosphate form performed by kinases. The nucleoside therapy implies therefore high dosage of drug involving severe side effects. This drawback can be overcome by developing bioreversible masked phosphorylated nucleoside prodrugs. The aim of this thesis was to establish the TriPPPro-approach, as the first promising nucleoside triphosphate prodrug concept. The concept was transferred to a large number of different modified antiviral agents in order to demonstrate the general applicability. Both, the chemical and enzymatic hydrolysis behavior should be investigated. A series of NTP prodrugs based on d4T as a model nucleoside analogue was prepared using a convergent synthesis strategy previously applied to the synthesis of DiPPro-nucleoside diphosphate (NDP) prodrugs. The acyl moieties as the masking units were varied by its chain length and modification for testing the prodrug permeability through cell membrane. Unfortunately, problems in the synthesis and purification of the needed nucleoside diphosphate (NDP) building block limited that route. A synthetic pathway was developed based on the nucleoside monophosphates (NMP) in order to achieve a more efficient conversion of the parent nucleoside. In general, NMPs are easier to access than NDPs. Thereby, a wide range of TriPPPro-compounds of different nucleoside analogues could be prepared via this new method. The analysis of the hydrolysis behavior in phosphate buffer (PBS, pH 7.3) revealed that the desired NTP was formed as the predominant compound. A concurrent reaction that involved breakage of the phosphoanhydride bond between beta- und gamma-phosphate led to the formation of NDP. The amount of NDP rose with increasing half-lives of the TriPPPro-compound. The hydrolysis studies conducted in the presence of isolated pig liver esterase (PLE) clearly led to a rapid and selective delivery of the biologically active NTP, if the substrate specificity is established. The release of NTPs was proven by primer extension assays and polymerase chain reactions. Hydrolysis half-lives in CEM cell extracts of the prodrugs correlated well with chain length and were significantly lower than the half-lives in PBS buffer. Additionally, the release of NTP was detected in biological media despite a rapid degradation by cellular enzymes such as phosphatases. As expected, the antiviral activity of the TriPPPro-d4TTP compounds against HIV-1 and HIV-2 also increased with increasing lipophilicity. Due to successful cell membrane penetration and the direct intracellular delivery of the higher phosphorylated metabolites an antiviral activity was accomplished, which was up to 3-fold higher than anti-HIV activity of the parent nucleoside. The dependence of lipophilicity and antiviral activity also retained in TK-deficient cells whereas d4T lacked anti-HIV activity. The successful intracellular delivery of NTP prodrugs was confirmed by a cellular uptake study using a flourescent NTP prodrug. The investigation of further nucleoside analogues revealed a significant improvement of their inhibition effects against HIV replication by using the TriPPPro-concept. The activity of a prodrug can be up to 21-fold higher than the activity of its parent nucleoside. Even, completely inactive nucleosides were converted to highly active NTP prodrugs against HIV-1. In conclusion, this thesis displays a general applicability of the TriPPPro-concept allowing the synthesis of different modified NTP prodrugs. This methodology might be a breakthrough which allows the currently active nucleosides either the future ones to rise their biological activity leading to improvements in antitumor and antiviral therapies.