| Zusammenfassung: | G-quadruplexes have more and more moved into focus of research in nucleic acids, thereby evolving in scientific significance from exceptional secondary structure motifs to complex modulators of gene regulation. A deeper understanding of their function and control may serve as an important milestone to elucidate regulatory mechanisms and help understand dysregulation. This might offer new opportuni... G-quadruplexes have more and more moved into focus of research in nucleic acids, thereby evolving in scientific significance from exceptional secondary structure motifs to complex modulators of gene regulation. A deeper understanding of their function and control may serve as an important milestone to elucidate regulatory mechanisms and help understand dysregulation. This might offer new opportunities for treatment options in the future.
Aptamers are monomolecular DNAs, RNAs or peptides with defined three dimensional folding,resulting in selective target specificity and affinity. In these characteristics, they resemble antibodies and they developed into a new class of therapeutically relevant biomolecules. They combine several advantages such as selectivity and high affinity to their target, simple and cheap synthesis with low batch to batch variability as well as high stability and low immunogenicity.
The aim of the present thesis was to further characterize the aptamer AIR-3 and its minimal binding motif AIR-3A (19 nt) with respect to its structure and specificity. Originally, AIR-3 was selected for binding to human Interleukin-6 receptor (hIL-6R), a key player in inflammatory diseases and cancer,and has recently been exploited for in vitro drug delivery studies. Concerning its structure, former studies gave only little insight. As such, it is known to date that AIR-3A forms an all-parallel G-quadruplex and that almost all nucleotides in the binding motif are essential to maintain affinity towards hIL-6R. Also, experimental data indicated that interaction with the target occurs via hIL-6R-domain D1.
By means of different methods, the structure, binding specificity and stoichiometry of AIR-3A were scrutinized in this study. Also, the influence of aptamer presence to cellular levels of membrane bound hIL-6R as well as tolerance of Air-3A integrity for nucleotide modifications were analyzed. In conclusion, these findings suggested a broader spectrum of folding species and targets for AIR-3A than assumed so far. Also, remarkable tolerance towards different pyrimidine modifications was found. Furthermore, the results hinted at a regulatory influence of AIR-3A on endocytosis and trafficking of hIL-6R. This could be an indication for hIL-6R regulation being (directly or indirectly)associated with cellular occurring G-quadruplexes. Against the background of recent advances in the elucidation of G-quadruplex mediated modulations these findings may help to increase understanding of hIL-6R associated dysfunctions.
G-Quadruplexe sind in den vergangenen Jahrzehnten mehr und mehr in den Fokus der Nukleinsäure- Forschung gerückt. Dabei entwickelte sich das Verständnis von ihrer Entdeckung als außergewöhnliche Sekundärstrukturmotive bis heute hin zu komplexen Modulatoren verschiedener Ebenen der Genregulation. Ein tieferes Verständnis ihrer Funktion und Kontrolle könnte einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung reg... G-Quadruplexe sind in den vergangenen Jahrzehnten mehr und mehr in den Fokus der Nukleinsäure- Forschung gerückt. Dabei entwickelte sich das Verständnis von ihrer Entdeckung als außergewöhnliche Sekundärstrukturmotive bis heute hin zu komplexen Modulatoren verschiedener Ebenen der Genregulation. Ein tieferes Verständnis ihrer Funktion und Kontrolle könnte einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung regulativer Mechanismen leisten und helfen, Dysregulationen
besser zu verstehen und neue Behandlungsmöglichkeiten zu eröffnen.
Aptamere sind monomolekulare DNA- oder RNA-Moleküle oder auch Peptide mit individueller dreidimensionaler Faltung und daraus resultierender Spezifität für die selektive Bindung an ein Zielmolekül. Sie besitzen also Antikörpern ähnliche Charakteristika und haben sich zu einer neuen Klasse therapeutisch relevanter Biomoleküle entwickelt. So verbinden sie die Vorteile einer selektiven, starken Bindung an das Zielmolekül, einfacher, kostengünstiger Synthese bei
gleichbleibender Qualität, hoher Stabilität und geringer Immunogenität.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung des Aptamers AIR-3 bzw. des 19 nt langen Bindemotivs AIR-3A bezüglich seiner Struktur und Spezifität. AIR-3 wurde zur Bindung an den humanen Interleukin-6-Rezeptor (hIL-6R) selektiert, dessen Fehlregulation mit der Prävalenz und Persistenz verschiedener Krankheiten assoziiert ist, und bereits für in vitro Wirkstofftransporte
eingesetzt. Strukturell ist über AIR-3A aus vorangegangenen Studien jedoch nur bekannt, dass es einen parallelen G-Quadruplex ausbildet und dass fast alle enthaltenen Nukleotide Bedeutung für die Interaktion mit hIL-6R haben. Auch wurden Hinweise gefunden, dass die Interaktion über Domäne D1 des hIL-6R erfolgt.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden deshalb die Struktur von AIR-3A sowie seine Bindespezifität und -stöchiometrie mittels verschiedener Verfahren genauer untersucht. Zudem wurde die Auswirkung der Anwesenheit des Aptamers auf die zelluläre Rezeptorpräsentation sowie der Einfluss von Nukleotid-Modifikationen auf die funktionelle Aptamerintegrität überprüft.
Anhand dessen konnte festgestellt werden, dass AIR-3(A) ein größeres Spektrum an Faltungen und Zielmolekülen besitzt als bisher angenommen wurde, und eine große Toleranz bezüglich verschiedener Modifikationen aufweist. Außerdem deuten die Ergebnisse auf einen regulativen Einfluss AIR-3As auf die Endozytose von hIL-6R hin. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass hIL-6R direkt oder indirekt durch zellulär vorkommende Quadruplexe beeinflusst wird. Vor dem Hintergrund aktueller Fortschritte in der Aufklärung G-Quadruplex-kontrollierter Mechanismen könnten diese Erkenntnisse helfen, das Verständnis für hIL-6R assoziierte Dysfunktionen zu mehren. |
