Pumilio-basierte Designerproteine zur sequenzspezifischen Detektion von RNA

Abstract

Die Entdeckung asymmetrisch verteilter eukaryotischer mRNAs in verschiedenen Organismen führte zu einem steigenden Interesse an den Mechanismen, die dieser Lokalisation zugrunde liegen und führte zur Entwicklung vielseitiger RNA-Detektionsmethoden. Von besonderem Interesse sind hierbei genetisch codierbare Sonden mit veränderbarer Spezifität. Ein System, das diese Kriterien erfüllt, ist die tetramolekulare Fluoreszenzkomplementierung (TetFC), welche die modulierbare Sequenzspezifität der Homologie-Domäne des RNA-bindenden Proteins Pumilio (Pum-HD) mit einem dreiteiligen grün fluoreszierenden Protein vereint. Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf der TetFC eine Methode zum Hochdurchsatz-Screening von Pumilio-Varianten in vivo entwickelt. Hierzu wurden verschiedene Strategien verfolgt und eine zeitlich versetzte Produktion der Ziel-RNA als geeigneter Ansatz bestimmt. Anhand dieses Systems war es möglich, zwischen der An- und Abwesenheit der Ziel-RNA sowie zwischen unterschiedlichen RNA-Sequenzen zu unterscheiden. Die TetFC wurde außerdem auf ein duales RNA-Detektionssystem ausgeweitet, mittels dessen die in vitro Unterscheidung zweier RNAs anhand unterschiedlicher Fluoreszenzsignale möglich war. Die Modifizierung des Signals wurde anhand der Verwendung einer Aminosäuresubstitution in einem der drei GFP-Fragmente realisiert. Die Nachweisgrenze des dualen TetFC-Systems betrug 16-32 nM. Die spezifische Detektion der einzelnen RNAs war zudem in Anwesenheit von eukaryotischem Zelllysat und bei einem Überschuss kompetitierender RNA gegeben. Die RNA-Detektion in Anwesenheit kompetitierender Pumilio-Varianten war nur teilweise erfolgreich und verdeutlichte die Wichtigkeit der Wahl geeigneter Pumilio-Kombinationen bei der dualen TetFC. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit der Pum-HD als Binde-Domäne für die sequenzspezifische Modifizierung in Kombination mit der Giardia lamblia Trimethylguanosinsynthase 2-Variante V34A (GlaTgs2-V34A) getestet, welche den Transfer funktioneller Gruppen von verschiedenen AdoMet-Analoga auf die 5‘-Kappe eukaryotischer mRNAs erlaubt. Es konnten verschiedene Pumilio-GlaTgs2-V34A-Fusionsproteine rekombinant produziert und gereinigt werden; eine Sequenzspezifität bei der enzymatischen Modifizierung von mRNA war jedoch nicht gegeben. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen das Potential der Pum-HD als Binde-Domäne in weiteren Designerproteinen. Insbesondere die Identifikation neuer Pum-HD-Varianten sollte in Zukunft zu einer vielseitigen Anwendbarkeit bei der sequenzspezifischen Detektion oder Modifikation von RNA in lebenden Zellen beitragen.

The discovery of asymmetrically localized eukaryotic mRNAs in various organisms has led to an increasing interest in the underlying mechanisms. Consequently, numerous RNA detection methods have been developed. Of particular interest are genetically encoded probes that hold the potential to be rationally designed. Tetramolecular fluorescence complementation (TetFC) is a method that meets these criteria; it combines the RNA-binding protein Pumilio homology domain (Pum-HD), which can be rationally designed to bind different RNAs sequence-specifically with a three-partite split-GFP. In this thesis, a TetFC-based strategy for high throughput screening of Pum-HD variants in vivo was developed. In order to integrate TetFC into E. coli different approaches were pursued and temporally independent production of target RNA proved to be a suitable strategy. The TetFC-based screening strategy allowed the differentiation between the presence and absence of a target RNA and even discrimination between different RNA sequences. Additionally, TetFC was expanded to a bicolor system which enabled in vitro differentiation of two closely related RNA sequences using different fluorescence signals. Alteration of the output signal was achieved by introducing a single amino acid substitution to one of the GFP fragments. The limit of detection was 16-32 nM. Specific detection of RNAs was also successful in presence of eukaryotic cell lysate and an excess of non-target RNA. However, in presence of Pum-HD variants that do not bind a certain RNA, specific RNA detection was also depending on the sequence of the target RNA, leading to the conclusion that the applied Pum-HD variants need to be chosen carefully for a bicolor TetFC. Pum-HD was also explored as binding domain for sequence-specific RNA modification using Giardia lamblia trimethylguanosinesynthase 2 variant V34A (GlaTgs2-V34A). GlaTgs2-V34A catalyzes the transfer of the side chain from different AdoMet analogs to the 5‘-cap of eukaryotic mRNAs. Recombinant protein production as well as purification of different Pumilio-GlaTgs2-V34A fusion proteins was successful, but a sequence-specific modification could not be observed. In summary, the results of this thesis demonstrate the potential Pum-HD holds as a binding domain for future designer proteins. Identification of new variants with optimal binding specificity should be especially important for the diverse applicability of sequence-specific RNA detection or RNA modification in living cells.