Analyse der Unterschiede pathogener und apathogener Entamoeba histolytica (SCHAUDINN, 1903) Klone in der Parasit-Wirt Interaktion

Abstract

Amöbiasis gehört nach Malaria und Schistosomiasis zu den weltweit häufigsten Parasitosen des Menschen. Sie wird durch das intestinale Protozoon Entamoeba histolytica hervorgerufen. Bei einem Großteil der Erkrankten besiedelt der Parasit asymptomatisch den Darm, während sich bei einer geringen Anzahl eine invasive Amöbiasis entwickelt. Bei der invasiven Form der Amöbiasis kann es zur Ausbildung von Amöbenlaberabszessen (ALA) durch E. histolytica kommen. Dabei ist ein komplexes Zusammenspiel aus Pathogenitätsfaktoren des Parasiten als auch Faktoren des Wirts maßgeblich für die Virulenzentstehung verantwortlich. Die bisher bekannten Pathogenitätsfaktoren des Erregers wurden jedoch sowohl in pathogenen als auch in apathogenen Amöben nachgewiesen. Wirtsspezifische Untersuchungen bezogen sich bisher nur auf pathogene Isolate, so dass der Vergleich zu inapparenten Verlaufsformen fehlt. Die für die Virulenzentstehung relevanten Mechanismen konnten somit bisher noch nicht identifiziert werden. Für diese Arbeit standen E. histolytica Klone zur Verfügung welche aus den HM-1:IMSS Isolat abstammenden Zelllinien A und B generiert wurden. Aufgrund von früheren Untersuchungen wurde die Klone der Zellllinie A für apathogen befunden. Die aus der Zelllinie B generierten Klone, weisen hingegen eine überraschend große Diversität in ihren Pathogenitätseigenschaften auf. Für diese Arbeit wurden der apathogene Klon A1 und der hoch-pathogene Klon B2 ausgewählt, um diese in einem direkten Vergleich gegenüberzustellen. Auf diesen Weg sollten putative Faktoren auf Erreger- als auch auf Wirtsseite identifiziert werden, die in die Virulenzentstehung involviert sein könnten. Zur näheren Charakterisierung der Pathogenität der E. histolytica Klone A1 und B2 wurde der zeitliche Verlauf der Infektion in zwei Tiermodellen der Amöbiasis in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die E. histolytica Klone A1 und B2 in beiden Amöbiasis-Tiermodellen unterschiedliche Fähigkeiten zur ALA-Induktion aufweisen. Obwohl der Klon A1 in der Lage ist eine Abszessbildung hervorzurufen, ist diese im Vergleich zu Klon B2 deutlich geringer ausgeprägt. Somit konnte sichergestellt werden, dass sich beide Tiermodelle für die Untersuchung von potentiellen Pathogenitätsfaktoren eignen und eine solide Basis für weiterführende Analysen darstellen. Mit Hilfe der mRNA-Sequenzierung wurden vergleichende Transkriptom-Studien zwischen den beiden Klonen A1 und B2 durchgeführt. Insgesamt konnten von 8386 gefundenen Gensequenzen 76 Gene identifiziert werden, die zwischen den beiden Klonen differentiell exprimiert sind. Der Großteil der in B2 höher regulierten Gene kodiert für hypothetische Proteine. Die Gene, die die höchsten Fold-Change-Werte aufweisen wurden höher exprimiert in dem Klon A1 gefunden. Die entsprechenden Gene kodieren für drei C2-Domänen-Proteine, drei Rab7 GTPasen und die Zelloberflächen-Protease gp63 (EhMP8-2). Weiterführende Analysen des Einflusses der identifizierten Proteine auf die ALA-Bildung mit transgenen Amöben konnten zeigen, dass EhC2-3, EhMP8-2 und ein hypothetisches Protein als putative Pathogenitätsfaktoren des Erregers in Betracht gezogen werden müssen. Neben den Pathogenitätsfaktoren von E. histolytica können auch wirtsspezifische Mechanismen bei einem Ausbruch der Amöbiasis eine wichtige Rolle spielen. Aufgrund der in dieser Arbeit erstmals durchgeführten Vergleiche auf Transkriptom-Ebene, von mit apathogenen und pathogenen Amöben infizierten murinen Lebern, konnten biologische Prozesse, vor allem der Lipidmetabolismus, identifiziert werden, die bei der ALA-Bildung eine entscheidende Rolle zu spielen scheinen. Des Weiteren konnten erfolgreich zwei Methoden etabliert werden, die es ermöglichen detaillierte Erkenntnisse über die Genexpression und die Motilität der Amöben in vivo zu erhalten. So konnten erfolgreich Trophozoiten aus murinen Lebern ex vivo reisoliert werden, aus denen quantitativ und qualitative geeignete RNA für weiterführende molekulare Studien zur Genexpression gewonnen werden konnte. Ebenso konnten erstmals pathogene Parasiten mit Superparamagnetischen Eisenoxid-Partikeln (SPIO) markiert werden und in vivo mittels Magnetresonanztomographie visualisiert werden. Diese Methode der nicht-invasiven in vivo-Visualisierung von SPIO-markierten Trophozoiten mittels MRT auf Einzelzellebene ermöglicht zukünftig Studien zur Motilität des Erregers sowie zur Interaktion von Parasit und Wirt.

Amoebiasis is an infectious disease caused by the parasitic protozoan Entamoeba histolytica. It is one of the most common parasitic diseases occurring in humans, following malaria and schistosomiasis. Most infected individuals harbor the parasite in the gut without clinical signs of disease. In approximately 10% of infected individuals, the parasite penetrates the intestinal mucosa and induces hemorrhagic colitis or the development of extra-intestinal abscesses, most common in the liver (ALA). A complex interplay of pathogenicity factors of the parasite itself as well as host-specific mechanisms determine the clinical outcome of the disease. Nevertheless all proposed pathogenicity factors are present in both, pathogenic and non-pathogenic amoeba. So far, host-specific investigations only deal with pathogenic isolates, meaning there are no comparisons towards asymptomatic infections. Hence, the mechanism of virulence is still unclear. For this work there were syngenic clones available that were generated from the laboratory strain HM-1:IMSS derived cell lines A and B, which consistently differ in virulence. All clones generated from cell line A are incapable to induce abscesses on day 7 post infection in Meriones unguiculatus, whereas clones generated from cell line B showed different degrees in virulence ranging from avirulent to highly virulent phenotypes. The non-pathogenic clone A1 and the highly aggressive clone B2 were selected for this work, to make a direct comparison for elucidating the parasitic and host-specific factors that deter-mine the clinical outcome of the disease and therefore are involved in amoeba pathogenicity. For further characterization of the pathogenicity of these two clones, a time course of infec-tion was performed using two different animal models of the disease. Both clones showed the capability to induce abscesses, although clone B2 provokes larger abscesses than clone A1. It could be proven, that both animal model represent a reliable tool for further investigating putative pathogenicity factors. A comparative transcriptome analysis of clone A1 and clone B2 was performed, using mRNA sequencing. Out of 8386 genes identified in this approach, 76 are differentially transcribed in the two clones. Most of the genes that showed a higher abundance in the pathogenic clone B2 code for hypothetical proteins. Genes with the highest fold change were found with a higher abundance in clone A1. These include three C2 domain containing proteins, three Rab7 GTPases and the cell surface protease gp63 (EhMP8-2). Further investigations with transgenic amoeba showed that EhC2-3, EhMP8-2 and one hypothetical protein have a sig-nificant influence on ALA development and are therefore considered to be putative patho-genicity factors of E. histolytica. Besides pathogenicity factors of the parasite, also host-specific mechanisms determine the clinical outcome of the disease. Therefore a comparative transcriptome analysis of murine livers after infection with non-pathogenic and pathogenic amoeba was performed for the first time. Due to this transcriptomic approach, biological processes, especially like the lipid me-tabolism, were identified to play an important role in ALA-development. Furthermore, two methods were established in this work that enable a more detailed study of amoebic gene expression and amoebic motility in vivo. The reisolation of amoebic trophozoites from murine livers after infection ex vivo succeeded successfully and the isolated RNA could be used for further molecular studies on gene expression. It was also demonstrated for the first time that a pathogenic parasite could be efficiently labelled with superparamagnetic iron oxid nanoparticles (SPIO) and being visualized using in vivo magnetic resonance imaging (MRI). This method represents in future a noninvasive imaging tool to study parasites, as well as host-specific pathomechanisms. In this work, proteins and metabolic pathways of the parasite as well as of the host could be identified, which might be responsible for ALA-development. Due to the different comparative transcriptomic approaches, a range of molecules was identified, which have to be considered as putative pathogenicity factors of both, parasite and host. The successful establishment of two new techniques could be a solid basis for future studies on amoeba pathogenicity to help clarify the origin of pathogenicity of E. histolytica.