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Titel: Evaluierung von rekombinanten Ansätzen zur Entwicklung artifizieller humaner Seren für eine diagnostische Standardisierung
Sonstige Titel: Evaluation of recombinant approaches for the development of artificial human sera for a diagnostic standardization
Sprache: Deutsch
Autor*in: Offermann, Nadine
Schlagwörter: Allergen spezifische Antikörper; Artifizielle humane Seren; FcγRI (CD64); Immunglobulin E; Standardisierungsmaterial; allergen specific antibodies; artificial human sera; FcγRI (CD64); immunoglobulin E; standardization material
Erscheinungsdatum: 2016
Tag der mündlichen Prüfung: 2017-02-24
Zusammenfassung: 
Für die Entwicklung, Validierung, Standardisierung und die Qualitätskontrolle von in vitro Diagnostika ist die Verfügbarkeit von gut charakterisierten Seren unverzichtbar. Humane Kontrollseren sind jedoch nicht für jeden Parameter in ausreichender Menge verfügbar. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit rekombinante Ansätze zur Entwicklung artifizieller humaner Seren (ARTHUS) für eine diagnostische Standardisierung zum Nachweis von allergenspezifischem Immunglobulin E (IgE), allergenspezifischem Immunglobulin G der Subklasse 4 (IgG4) und Autoantikörpern der Subklasse 1 (IgG1) evaluiert. Grundprinzip dabei war die Verknüpfung von spezifischen, tierischen Antikörpern und rekombinanten Adapter-Molekülen, die geeignet sind, mit den spezifischen Antikörpern stabile Interaktionen einzugehen.
Als Quelle polyklonaler, spezifischer Antikörper gegen rekombinant hergestellte und native Allergene als auch Allergenextrakte wurden primär Seren immunisierter Kaninchen verwendet. Die Proteinzusammensetzung der hierfür eingesetzten Allergenextrakte wurde vor Immunisierung analysiert und die resultierenden Immunreaktivitäten der allergenspezifischen Antikörper nach Immunisierung mittels biochemischer und immunologischer Methoden evaluiert.
Parallel wurden rekombinante Fusionsproteine, welche aus den konstanten Regionen des humanen IgEs und dem humanen FcγRI Rezeptor (CD64) bzw. einem avianen IgY Rezeptor bestehen, entwickelt und in humanen Zelllinien exprimiert. Nach Optimierung der Immunreaktivität durch antigenspezifische Reinigung und der Konzentrationsverhältnisse von allergenspezifisch gereinigten Antikörpern und rekombinanten Adapter-Molekülen konnte erfolgreich gezeigt werden, dass die artifiziellen humanen Seren in drei unterschiedlichen Testsystemen sehr gute Übereinstimmungen mit humanen Seren aufweisen.
Weiterhin konnten allergenspezifische, artifizielle humane Seren für die Verwendung in einem Testsystem zum Nachweis von spezifischem IgG4 (sIgG4), einem wichtigen Parameter für die allergenspezifische Immuntherapie, dargestellt werden.
Darüber hinaus wurden artifizielle Seren zum Nachweis von IgG1 entwickelt. Hierbei wurde durch gezielte Mutation eine Variante des IgG1 Fc konstruiert, die keine Interaktion mit dem humanen FcγRI Rezeptor zeigte. Eine mögliche Bindung zwischen dem CD64 Rezeptor eines Moleküls mit dem IgG1 Fc eines zweiten Fusionsmoleküls wurde dadurch unterdrückt. Ein auf dieser Variante beruhendes Konstrukt konnte erfolgreich als Komponente artifizieller humaner IgG1 Seren zur Standardisierung von Testsystemen zum Nachweis von anti-Doppelstrang DNA (dsDNA)-spezifischen Antikörpern verwendet werden. Hierbei konnte der Nachweis geführt werden, dass auch monoklonale murine Antikörper für die Darstellung artifizieller humaner Seren genutzt werden können, was die hohe Flexibilität des verfolgten Ansatzes zusätzlich erweitert.
Zudem führte ein alternativer Ansatz, unter Verwendung eines CHIR-IgE Fc Konstrukts, ebenfalls zu funktionellen ARTHUS für die in vitro Allergie-Diagnostik. Der verwendete CHIR Rezeptor ermöglicht, im Gegensatz zum CD64 Rezeptor, den Einsatz von spezifischen-IgY Antikörpern zur Realisierung artifizieller Kontrollen und erweitert somit das Spektrum der möglichen antigenspezifischen Antikörper-Isotypen.
Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren, dass ARTHUS zur Entwicklung, Validierung, Standardisierung und Qualitätskontrolle von in vitro Diagnostika beitragen können. Prinzipiell sind ARTHUS mit unterschiedlichen Spezifitäten gegen nahezu jede Struktur, inklusive Proteine, Peptide und Kohlenhydrate, denkbar. Der Einsatz monoklonaler Antikörper ergänzend zu polyklonalen Antikörpern, bietet zudem die Möglichkeit mittels ARTHUS gezielte Epitope und deren Zugänglichkeit in den verschiedenen Testsystemen zu analysieren. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten und evaluierten Möglichkeiten zur Etablierung von artifiziellen Seren werden zu einer verbesserten Diagnostik und damit auch zu verbesserten Therapieentscheidungen sowie einem verlässlicheren Verlaufsmonitoring beitragen und damit helfen, einer Vielzahl von Erkrankungen adäquat zu begegnen.

The availability of well-defined quality controls is essential required for the development, validation, standardization and quality control of in vitro diagnostics. However, the availability of human control sera is limited regarding different parameters and sufficient amounts. Therefore the aim of the present thesis was to evaluate recombinant approaches for the development of artificial human sera (ARTHUS). ARTHUS should contribute to diagnostical standardization for the determination of allergen-specific immunoglobulin E (IgE), allergen-specific immunoglobulin G of subclass 4 (IgG4) and autoantibodies of subclass 1 (IgG1). The basic principle was the fusion of specific animal antibodies and recombinant adaptor molecules, which are able to assume stable interactions with the specific antibodies.
Polyclonal, specific antibodies were produced in rabbits by immunization with purified recombinant and native allergens as well as whole allergen extracts. The protein composition of the used allergen extracts were analyzed before immunization. After immunization, resulting immunoreactivities of allergen-specific antibodies were evaluated by biochemical and immunological methods.
In parallel recombinant fusion proteins were designed and expressed in human cell lines. These fusion proteins comprising the constant domains of human IgE and the human FcγRI receptor (CD64) or an avian IgY receptor, respectively. After optimization of the immunoreactivities by antigen-specific purification and adjustment of the ratio between allergen-specific antibodies und recombinant adaptor molecules, artificial human sera showed comparable results with human sera obtained in three different test systems.
Furthermore allergen-specific, artificial human sera could be realized for the use in a test system for the determination of specific IgG4 (sIgG4), an important parameter for the allergen-specific immunotherapy.
In addition artificial human sera for the determination of IgG1 were developed. For that purpose an IgG1 Fc variant with a specific mutation was designed, which was unable to interact with the human FcγRI receptor. Thereby an imaginable binding between the CD64 receptor of one molecule with the IgG1 Fc domains of a second fusion protein was prevented. Such a construct could successfully used as component of artificial human IgG1 sera for standardization of test systems for the determination of dsDNA-specific antibodies. Moreover these results demonstrated that monoclonal murine antibodies can be used for production of artificial human sera. This fact expands the high flexibility of the traced approach.
Additionally an alternative preparation using a CHIR-IgE Fc construct also led to functional ARTHUS for the allergy in vitro diagnostic. Contrary to the CD64 receptor the CHIR receptor offers the use of specific-IgY antibodies for the implementation of artificial controls. Consequently the spectrum of potential antigen-specific antibody isotypes is extended.
The present results demonstrate that ARTHUS are able to contribute to the development, validation, standardization and quality control of in vitro diagnostics. Generally ARTHUS with specificity for virtually any target structure of interest including proteins, peptides and carbohydrates are feasible. Additional to polyclonal antibodies the use of monoclonal antibodies provides the potential to analyze specific epitopes and their accessibility in different test systems by ARTHUS. The developed and evaluated options in the present thesis allows for an improved diagnostic. Thereby ARTHUS are also able to improve therapy decisions as well as monitoring and finally help to face huge variety of diseases adequately.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/7139
URN: urn:nbn:de:gbv:18-84331
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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