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Titel: Entwicklung, Etablierung und Validierung eines Tests basierend auf Next Generation Sequencing zur genetischen Diagnostik beim Verdacht auf erbliche Phäochromozytome und Paragangliome
Sonstige Titel: Development, establishment and validation of a test based on Next Generation Sequencing for genetic diagnosis in cases of suspected pheochromocytomas and paragangliomas
Sprache: Deutsch
Autor*in: Stubbe, Annika Denise
GND-Schlagwörter: Next Generation Sequencing; Ion PGM; Endokrinologische Tumore; Phäochromozytom; Paragangliom
Erscheinungsdatum: 2016
Tag der mündlichen Prüfung: 2017-06-02
Zusammenfassung: 
Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel der Entwicklung, Validierung und Etablierung eines genetischen Tests basierend auf dem Next Generation Sequencing (NGS) zur schnelleren genetischen Diagnostik beim Krankheitsbild eines Phäochromozytoms oder Paraganglioms.
Es wurden elf diagnostisch relevante Gene mit den drei Methoden NGS, Sanger-Sequenzierung und multiplexe ligationsabhängige Sondenamplifikation (MLPA) untersucht. Zur Validierung wurden die mit den 3 Methoden erhaltenen Ergebnisse miteinander verglichen. Für das NGS-Sequenzieren wurde die Plattform Ion Torrent von Thermofisher Scientific verwendet. Es wurde ein Primer-Panel designed, mit dem die Gene KIF1B, MAX, NF1, RET (Exons 8, 10, 11, 13, 14, 15 und 16), SDHAF2, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, TMEM127 und VHL in einem Analysegang untersucht werden können. Es wurden 28 Proben von Patienten mit einem Phäochromozytom oder Paragangliom untersucht.
Die Auswertung der sehr großen NGS-Datenmengen wurde mit dem Modul ,,SeqNext“ des Programms ,,SeqPilot“ durchgeführt. Zusätzlich zur Analyse der Rohdaten wurde auch eine Qualitätsbewertung der Daten vorgenommen.
Der Vergleich zeigte, dass insgesamt 96 Varianten mit dem NGS und der Sanger-Sequenzierung im vergleichbaren Analysebereich nachgewiesen werden konnten. Zwei Varianten im Intronbereich wurden nur mit dem NGS gefunden und konnten noch nicht abschließend hinsichtlich ihrer Identität geklärt werden. Mit der MLPA und der CNV-Analyse des NGS wurde eine Deletion der Exons 2-8 im SDHB-Gen in einer Patientenprobe nachgewiesen.
Insgesamt wurden 2 Nonsense-, 18 Missense-, 31 Silent- und 92 Intron-Varianten mit der Sanger-Sequenzierung und dem NGS nachgewiesen. Die Varianten wurden mit verschiedenen in silico Tools bezüglich ihrer funktionellen Auswirkung und Pathogenität betrachtet. Für die Silent-Varianten wurde als weiteres Kriterium die Minor Allele Frequency herangezogen, um die Beurteilung der klinischen Relevanz anhand der Häufigkeit der Variante in der Durchschnittsbevölkerung vornehmen zu können. Die Intron-Varianten außerhalb der bekannten Spleiß-Regionen wurden nicht näher betrachtet.
Das NGS-Primer-Panel bot keine 100%ige Analysierbarkeit der elf Gene. Insgesamt mussten 11 von 160 Exons mit der Sanger-Sequenzierung sequenziert werden. Die Datenanalyse zeigte zudem, dass die CNV-Analyse basierend auf den NGS-Daten momentan nicht die Qualität besitzt, die MLPA zu ersetzen.
Der in dieser Arbeit entwickelte und validierte Test kann in der Routinediagnostik eingestzt werden und bietet mit entsprechender Proben-Auslastung sowohl eine Kosten- als auch eine Zeitersparnis.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/7245
URN: urn:nbn:de:gbv:18-85717
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Höppner, Wolfgang (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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