Einfluss des Hormons Vitamin D3 auf die Hepatitis B sowie Einfluss pflanzlicher Limonoide und Phytosterole auf die Hepatitis-C-Virus-Replikation im Zellkulturmodell

Abstract

Die viralen Hepatitiden B und C sind ein weltweites Problem mit mindestens 240 Mil- lionen persistent mit Hepatitis-B-Virus (HBV) und mindestens 130 Millionen mit Hepa- titis-C-Virus (HCV) infizierten Personen weltweit. Daraus resultieren knapp 700.000 Todesfälle durch Hepatitis B assoziierte und mindestens 700.000 Todesfälle durch Hepatitis C assoziierte Erkrankungen, wie Leberzirrhose oder hepatozelluläres Kar- zinom (GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators 2015, Lozano et al. 2012). In klinischen Studien wurde der Zusammenhang zwischen niedrigeren Vita- min-D3-Serumspiegeln und schlechterem Ansprechen der antiviralen Therapie postu- liert (Farnik et al. 2013). Um diesen klinischen Zusammenhang in vitro zu untersu- chen, wurden zwei HBV-transgene Zelllinien (HepG2.2.15-, HepG2-H1.3-Zellen) verwendet. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach 72 Stunden Inkubationszeit 1.) 10 μM Vitamin D3 zu einer signifikanten Reduktion von entspannt- zirkulärer Desoxyribonukleinsäure (rcDNA) des Hepatitis-B-Virus im Zellkulturüber- stand beider Zelllinien führte, sowie 2.) 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 in den Konzentra- tionen von 0,1 μM und 1 μM eine Verringerung der Hepatitis-B-Virus- Oberflächenantigene (HBsAg) und rcDNA von HepG2-H1.3-Zellen im Zellkulturüber- stand bewirkt. Eine mögliche Schlussfolgerung daraus ist, dass Vitamin D3 bezie- hungsweise 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 die Elimination des Hepatitis-B-Virus aus den Hepatozyten unterstützen und somit klinisch zu höheren dauerhaften virologischen Therapieansprechraten (SVRs) führen könnte. In bis zu 10% der Fälle liegt eine kombinierte Infektion von HBV und HCV vor. Da der Verlauf einer kombinierten Infektion wesentlich fulminanter ist, ist eine effektive Be- handlung beider Erkrankungen anzustreben (Gaeta et al. 2006). Neue Medikamente wirken mit einer SVR von über 90%, jedoch sind sie teuer und weisen diverse Ne- benwirkungen auf (Lawitz et al. 2013). Die Tagestherapiekosten sind insbesondere für Erkrankte in Ländern mit einem niedrigen Durchschnittseinkommen nicht finan- zierbar. Gerade in diesen Ländern ist jedoch eine hohe Prävalenz an Hepatitis- Seropositiven vorhanden (World Health Organisation 2016b). Bezahlbare Alternativ- medikamente mit möglichst wenigen Nebenwirkungen könnten Abhilfe schaffen. Da in der traditionellen afrikanischen Medizin schon lange Pflanzen gegen verschiedene Erkrankungen erfolgreich eingesetzt wurden (Tsamo Tontsa et al. 2013), ist die Er- forschung der Wirkstoffe essentiell. Bereits erforschte Inhaltsstoffe aus Pflanzen der Familie Meliaceae zeigten hepatoprotektive Effekte (Germanò et al. 2005), sodass in der vorliegenden Arbeit mit der afrikanischen Pflanze Tichilia welwitschii aus der Fa- milie der Meliaceae gearbeitet wurde. Da die Hepatitis-C-Virus Genotypen 1a und 2 mit 25,6% beziehungsweise 4,8% sehr häufig vorkommen (Kartashev et al. 2016), wurden diese im Zellkulturmodell (LucUbiNeo-ET-, JFH-LucUbiNeo-Zellen) verwen- det. Die vorliegende Arbeit zeigt dabei, dass 1.) die aus Tichilia welwitschii gewonne- nen Limonoide TWF5, TWF9 und TWF10 in den eingesetzten Konzentrationen kei- nen antiviralen Effekt aufwiesen, sowie 2.) die ebenfalls aus der Pflanze gewonne- nen Phytosterole TWT1 und TTA6 zu einer Verminderung der Chemilumineszenz in LucUbiNeo-ET- und JFH-LucUbiNeo-Zellen führten, was gleichzusetzen ist mit einer Reduktion der viralen Last. Dabei betrug die EC50 von TWT1 in LucUbiNeo-ET-Zellen 1,186 μM (95% KI: 0,9204 – 1,529) und in JFH-LucUbiNeo-Zellen 1,272 μM (95% KI: 1,014 – 1,596) nach 48 Stunden Inkubationszeit. Die EC50 von TTA6 in LucUbiNeo- ET-Zellen betrug 6,333 μM (95% KI: 5,556 – 7,219) und in JFH-LucUbiNeo-Zellen ≈ 29,71 μM nach 48 Stunden Inkubationszeit. Es sollten zukünftig weitere Studien mit diesen Substanzen durchgeführt werden, um die gezeigten Daten zu validieren.

The viral hepatitis B and C are a global problem with at least 240 million persistent hepatitis B virus (HBV) and at least 130 million with hepatitis C virus (HCV) infected individuals worldwide. This results in at least 700,000 deaths due to hepatitis B- associated and at least 700,000 deaths due to hepatitis C-associated diseases, such as cirrhosis or hepatocellular carcinoma (HCC) (GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators 2015, Lozano et al. 2012). The relationship between lower vita- min D3 serum levels and lower response of antiviral therapy was postulated in clinical trials (Farnik et al. 2013). To investigate this clinical context in vitro, two HBV trans- genic cell lines (HepG2.2.15, HepG2 H1.3 cells) were used. In the present study is showed that after 72 hours of incubation 1.) 10 μM Vitamin D3 leads to a significant reduction of relaxed-circular Deoxyribonucleic Acid (rcDNA) of hepatitis B virus in the cell culture supernatant of both cell lines, and 2.) 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 in the concentrations of 0.1 μM and 1 μM causes a reduction in hepatitis B virus surface antigens (HBsAg) and rcDNA of HepG2 H1.3 cells in the cell culture supernatant. One possible conclusion is that vitamin D3 or 1α,25-dihydroxyvitamin D3 eliminates the Hepatitis B virus from the hepatocytes and so there are clinically higher sustained virological responses (SVRs). In up to 10% of cases there is a combined infection with HBV and HCV. Since the course of disease of a combined infection is much more fulminant, an effective treat- ment of both diseases is needed (Gaeta et al. 2006). New drugs interact with a SVR of 90%, but they are expensive and have various side effects (Lawitz et al. 2013). The pricing is particularly important for countries with a low average income because these countries have a high prevalence of infected individuals (World Health Organi- sation 2016b). Alternative medications with as low as possible side effects are re- quired. For a long time in the traditional African medicine plants have been success- fully used against various diseases (Tsamo Tontsa et al. 2013). Exploring the main active pharmaceutical ingredients is essential. Already researched ingredients from plants of the family Meliaceae showed hepatoprotective effects (Germanò et al. 2005). So that is the reason why the African plant Tichilia welwitschii from family of Meliaceae was used in the present work. Because hepatitis C virus genotypes 1a and 2 are with 25.6% and 4.8% very common (Kartashev V et al. 2016), these geno- types were used as the cell model (LucUbiNeo-ET, JFH-LucUbiNeo cells). The pre- sent study shows that 1.) the isolated substances from Tichilia welwitschii, the limo- noides TWF5, TWF9, TWF10 in the used concentrations had no antiviral effect, and 2.) the plant phytosterols TWT1 and TTA6 lead to a reduction of chemiluminescence in LucUbiNeo-ET and JFH-LucUbiNeo cells, which is equivalent to a reduction in viral load. After 48 hours of incubation the EC50 of TWT1 in LucUbiNeo-ET cells was 1.186 μM (95% CI: 0.9204 to 1.529) and of JFH-LucUbiNeo cells was 1.272 μM (95% CI: 1.596 to 1.014). The EC50 of TTA6 in LucUbiNeo-ET cells was 6.333 μM (95% CI: 5.556 to 7.219) and in JFH-LucUbiNeo cells ≈ 29.71 μM after 48 hours of incubation. Further research with these substances or other substances of the class of phy- tosterols should be carried out in future to show the reduction of virus in vivo.