Entwicklung und Charakterisierung von HIV-1 Latenzmodellen und proviralen Aktivatorsystemen

Abstract

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit dem Thema HIV-Latenz. Das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) integriert in das Genom der Wirtszelle, was zu einer Etablierung von latent infizierten Zellreservoiren führt und eine lebenslange Behandlung HIV-infizierter Patienten mit antiretroviralen Medikamenten notwendig macht. Latent infizierte Zellen exprimieren keine viralen Gene und können daher nicht vom Immunsystem erkannt und eliminiert werden und bieten keinen Angriffspunkt für antiretrovirale Medikamente. Latente Zellreservoire stellen deshalb eine entscheidende Hürde bei der Entwicklung von kurativen Therapiestrategien dar. Da latent infizierte Zellen phänotypisch nicht von produktiv infizierten Zellen zu unterscheiden sind, ist es zudem schwierig, latent infizierte Zellen zu isolieren und funktionell zu charakterisieren. Die Aktivierung von latenten Proviren und eine sich anschließende Eliminierung durch CD8+ T-Zellen wird als essentieller Bestandteil einer erfolgreichen Eradizierungsstrategie angesehen. Die zurzeit klinisch erprobten pharmakologischen Aktivierungsreagenzien wirken indirekt über zelluläre Signalwege und führen deshalb nur zu einer unvollständigen Aktivierung und zu keiner Reduzierung des latenten Reservoirs. In Rahmen dieser Arbeit wurden zum einen neue Zellkulturmodelle für HIV-Latenz etabliert, welche die Charakterisierung von latent infizierten Zellen und Testung von Aktivierungsstrategien erlauben. Es wurde ein zweifach fluoreszenzmarkiertes provirales Reporterkonstrukt verwendet, mithilfe dessen sich latent infizierte Jurkat Zellen identifizieren und isolieren und somit Latenzzelllinien generieren ließen. Zudem ermöglicht der Reporter die durchflusszytometrische Verfolgung der Aktivität des HIV long terminal repeat (LTR)-Promotors. Generierte Latenzzelllinien wurden genauer charakterisiert und die Integrationsstellen bestimmt. Die Zelllinie HIVisB2 diente zur Untersuchung des Einflusses von Aktivierungsreagenzien auf verschiedene Latenzreportersysteme. Hierbei zeigte sich, dass Aktivierungsreagenzien in verschiedenen Modellen unterschiedlich wirken und nicht in einem einheitlichen Maße aktivieren. Zudem wurde eine Übertragung des Reportersystems auf primäre Zellen getestet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden neue Aktivierungsmethoden für HIV-Latenz erprobt. Es wurden zwei CRISPR/Cas9-abgeleitete Aktivatorsysteme, das SAM- und das SunTag-System, an den HIV-1 LTR-Promotor adaptiert und hinsichtlich ihrer Aktivierung von HIV proviraler DNA untersucht. CRISPR/Cas9-abgeleitete Aktivatorsysteme bestehen aus einer enzymatisch inaktiven Cas9 Nuklease und multiplen Aktivierungsdomänen und führen zu einer sequenzspezifischen transkriptionellen Aktivierung. Es konnte eine optimale Zielregion im LTR-Promotor identifiziert werden. Das SAM-System war dem SunTag-System deutlich überlegen und führte in verschiedenen Latenzmodellen zu einer robusten und vollständigen transkriptionellen Aktivierung des Provirus. Die Aktivierung resultierte in der Freisetzung infektiöser viraler Partikel, was eine Voraussetzung für einen Einsatz solch neuartiger Aktivierungsmethoden als Bestandteil einer möglichen Eradizierungsstrategie wäre. CRISPR/Cas9-abgeleitete Aktivatorsysteme stellen somit ein vielversprechendes Werkzeug für die Induzierung und Quantifizierung des latenten Reservoirs ex vivo dar, und könnten in Zukunft in Verbindung mit geeigneten Vektorsystemen zur Entwicklung neuartiger kurativer Therapieverfahren bei HIV/AIDS beitragen.

The subject of this dissertation is HIV latency. Human immunodeficiency virus (HIV) integrates into the host cell genome which leads to the establishment of latently infected cell reservoirs and makes life-long antiretroviral treatment necessary for HIV-infected patients. Latently infected cells do not express any viral genes and therefore cannot be recognized and eliminated by the immune system of the host and do not present any target for antiretroviral drugs. Thus, latent reservoirs represent a critical obstacle for the development of curative therapy strategies. Since latently infected cells are phenotypically indistinguishable from productively infected cells, it is difficult to isolate and characterize latently infected cells. Complete activation of latent proviruses and subsequent elimination by CD8+ T cells is considered to be a major building block for the development of successful eradication strategies. However, the currently clinically tested activating pharmacological reagents act indirectly through cellular pathways and, hence, only result in incomplete activation with no effect on the size of the latent reservoir Within the scope of this study, new cell culture model systems for HIV latency, which allow the characterization of latently infected cells and testing of activation strategies, were established. A dual fluorescently labelled proviral reporter construct was used, which enabled identification and isolation of latently infected Jurkat cells and subsequent generation of clonal lines. In addition, the reporter construct allows flow cytometric monitoring of HIV long terminal repeat (LTR) promoter activity. Generated latency cell lines were further characterized and integration sites were determined. The generated latency cell line HIVisB2 was employed for the investigation of activating reagents in different latency reporter systems. Activating reagents showed to not activate uniformly in different models. Moreover, ways of transferring the latency reporter to primary cells were tested. In the second part of this work new activation methods for HIV latency were investigated. Two CRISPR/Cas9-derived activator systems, the SAM- and SunTag-system, were adapted for the HIV-1 LTR promoter and tested with respect to activate HIV proviral DNA. CRISPR/Cas9-derived activator systems are composed of enzymatically inactive Cas9 nuclease and multiple transactivation domains and lead to sequence-specific transcriptional activation. An optimal target region for activation was identified within the HIV-1 LTR promoter. The SAM-system revealed to be superior to the SunTag-system and showed specific and robust transcriptional provirus activation in different latency models. Activation was complete, resulting in release of infectious viral particles, which is a prerequisite for the implementation of such new activation methods in a potential eradication strategy. CRISPR/Cas9-derived activator systems may therefore represent a promising tool for induction and quantification of latently infected reservoirs ex vivo and, together with advanced vector systems, could be part of novel curative approaches for HIV/AIDS.