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Titel: New Methods for Characterization of N-type Glycosylation of Proteins by Integration of LC-MS/MS and NMR
Sonstige Titel: Neue Methoden für die Charakterisierung der N-typ-Glycosylierung von Proteinen durch Korrelation von LC-MS/MS und NMR
Sprache: Englisch
Autor*in: Wiegandt, Alena
Schlagwörter: Massenspektrometrie; Chromatographie; NMR; Glycosylierung; Fucosylierung; Monoklonale Antikörper; Plasmaprotein; mass spectrometry; chromatography; NMR; glycosylation; fucosylation; monoclonal antibody; plasmaprotein
Erscheinungsdatum: 2016
Tag der mündlichen Prüfung: 2017-04-07
Zusammenfassung: 
Als eine der wichtigsten post-translationalen Modifikationen von Biomolekülen beeinflusst die Glycosylierung eine Vielzahl regulatorischer Funktionen. Daher kann der Zusammenhang zwischen veränderter Glycosylierung und pathogenen sowie immunogenen Prozessen einer Entwicklung eines spezifischeren Biomarkers dienen, als es die Proteinkonzentration selbst könnte. Die Analyse des Glycoms ist insbesondere für zwei biomedizinische Bereiche relevant, welche daher im Rahmen dieser Arbeit betrachtet wurden: A) Qualitätskontrolle von Biopharmazeutika sowie B) Entwicklung von Biomarkern für eine verbesserte Diagnostik.
Studien haben kürzlich gezeigt, dass Cetuximab, ein in der Krebstherapie eingesetzter mono-klonaler Antikörper, aufgrund anaphylaktischer Schocks schwere allergische Reaktionen bis hin zum Tod hervorrufen kann. In dieser Arbeit konnten zum ersten Mal nicht-humane Glycosylierungsepitope eindeutig identifiziert werden, welche für diese Reaktionen verantwortlich sind. Von den 37 N-Glycan-Zusammensetzungen, die in einem bottom up-Ansatz identifiziert wurden, konnten die zehn häufigsten durch Anwendung einer hier optimierten Variante der sogenannten 3DCC-Methode (three-dimensional cross correlation), welche LC-MS- und NMR-Daten kombiniert, strukturell charakterisiert werden. So besitzen 24% aller detektierten Glycane -(13)-Gal-Epitope und/oder N-Glycolylneuraminsäuren, die die genannten schweren Immunreaktionen auslösen.
Komplementär zu dieser detaillierten, aber aufwendigen Analyse wurde eine schnelle bio-informatische Glycosylierungsanalyse auf der Ebene intakter Glycoproteine entwickelt. Sie basiert auf einem Least-Square-optimierten Fit des isotopenaufgelösten experimentellen MS-Spektrums durch theoretische Glycoform-Spektren. Die größte Herausforderung stellte dabei die Implementierung mehrerer Glycosylierungsstellen pro Protein dar. Die Bestimmung der N-Glycane erlaubt Rückschlüsse auf die Sicherheit sowie die Effizienz rekombinanter Antikörper. Ein middle up-Ansatz, der auf der Analyse von mAb-Subdomänen basiert, wurde etabliert, um eine positionsspezifische Glycosylierungsanalyse zu ermöglichen und potentiell unerwünschte Glycanepitope zu lokalisieren. Anhand dieser Methode wurden verschiedene kommerziell erwerbliche Chargen von Bevacizumab, einem in der Krebstherapie verwendeten mAb, hinsichtlich ihrer Glycosylierung untersucht. Hiermit war es möglich, Unterschiede der Glycosylierung zu identifizieren und die Chargen hinsichtlich ihrer therapeutischen Effizienz zu vergleichen. In einer laborübergreifenden Studie, die durch das National Institute of Standards and Technology (NIST) organisiert wurde, wurden sowohl die oben beschriebenen bottom up-Analysen als auch solche von intakten Glycoproteinen durchgeführt. Eine erste statistische Analyse der eingereichten Datensätze (n = 93) durch NIST bestätigte anschließend, dass dieser multi-dimensionale Ansatz exzellente Ergebnisse liefert.
Prolactin-Inducible Protein (PIP), ein Glycoprotein, das in humanen Sekreten auftritt, konnte mit diversen biologischen Funktionen in Verbindung gebracht werden, beispielsweise der Tumorentstehung. Seine Glycanstrukturen wurden bisher nicht detailliert beschrieben. Daher wurde PIP in dieser Arbeit aus Speichel isoliert und mittels LC-MS/MS und NMR analysiert. Es zeigte sich, dass PIP eine ungewöhnliche N-Glycosylierung aufweist, die durch einen extrem hohen Fucosylierungsgrad gekennzeichnet ist. NMR-Analysen identifizierten diese hoch-fucosylierten N-Glycanepitope als Lewisy (Ley)-Strukturen, deren Expression typischerweise während der Tumorentstehung hochreguliert wird. Somit wurden zum ersten Mal N-Typ-Ley-Antigene auf einem spezifischen Glycoprotein eindeutig charakterisiert. Die Analyse der PIP-Glycosylierung verschiedener gesunder Individuen zeigte, dass bei diesen ohne Ausnahme ein hoher Fucosylierungsgrad herrscht. Es besteht eine inverse Korrelation zwischen der Menge von Fucosen sowie Sialinsäuren: Je mehr Sialinsäuren an die Glycane gebunden sind, desto geringer wird der Fucosylierungsgrad. 40% aller Individuen sind heterozygot für einen single nucleotide polymorphism (SNP), der die Aufspaltung der Proteinsignale bewirkt. Dieser Aminosäuren-austausch beeinflusst das Glycosylierungsmuster: Die Gesamtfucosylierung ist reduziert, während die Gesamtsialylierung erhöht ist.
Lectinstudien haben gezeigt, dass Histidine-Rich Glycoprotein (HRG) eine veränderte Glycosylierung bei Darmkrebserkankungen aufweist. Darmkrebs ist durch geringe Überlebensraten gekennzeichnet, typischerweise begründet durch eine späte Diagnose. Eine frühere Diagnose könnte durch die Entwicklung eines Bluttestes ermöglicht werden. In dieser Arbeit konnte eine Isolierungsstrategie für HRG aus Blutplasma erfolgreich etabliert werden. Erste Glycosylierungsanalysen zeigten eine hohe Einheitlichkeit zwischen verschiedenen Individuen.

As one of the most important post-translational modifications of biomolecules, glycosylation significantly affects a variety of biological functions. Thus, the correlation between altered glycan structures and pathogenic or immunogenic processes is not surprising, often resulting in a specific marker for such processes. The analysis of the glycome is among others especially relevant within two biomedical areas that were therefore addressed in this thesis: A) quality control of biopharmaceuticals and B) development of biomarkers for improved diagnostics.
Recent studies have revealed, that Cetuximab, a monoclonal antibody used for treatment of cancer, causes severe, even deadly, allergic immune reactions due to anaphylactic shocks. In this work, non-human glycosylation epitopes that cause these fatal reactions were unambiguously identified for the first time. From 37 N-glycan compositions that were identified by a bottom up approach, the ten most abundant ones were structurally characterized by developing an optimized version of the three-dimensional cross correlation (3DCC) that mathematically combines LC-MS with NMR data. 24% of all detected glycans possess the immunogenic -(13)-Gal epitope and/or N-glycolyl neuraminic acid that can cause severe immune reactions.
Complementary to this detailed but demanding analysis, a bioinformatic tool for a fast glycosylation analysis on the intact glycoprotein level was developed. It is based on a least-square-optimized fit of the isotope-resolved experimental MS spectrum by theoretical glycoform spectra. The most challenging aspect was the implementation of multiple glycosylation sites per molecule. The determination of the attached N-glycans allows conclusions about safety as well as efficiency of recombinant mAbs. A middle up approach, analyzing mAb sub-domains, was established in order to enable a site-specific analysis of glycosylation and localization of potentially inappropriate glycan epitopes. By use of the developed tool, different batches of commercially available Bevacizumab, a mAb used in therapy of various cancer diseases, were analyzed regarding their glycosylation profile. It was possible to identify distinct variations of glycosylation between batches that are associated with biopharmaceutical efficiency. In an interlaboratory study organized by the National Institute of Standards and Technology (NIST), the multi-dimensional approach developed here, combining bottom up as well as intact glycoprotein analyses, was applied. Statistical analysis of data from all submitted reports (n = 93) by NIST confirmed that this approach yields excellent results.
Prolactin-Inducible Protein (PIP), a glycoprotein found in human secretions, has been demonstrated to be involved in important biological functions, such as tumor progression. Glycan structures attached to PIP have not been studied in detail so far. Therefore, PIP isolated from saliva was analyzed by LC-MS/MS and NMR in this thesis. It was found that PIP holds a very unusual N-glycosylation characterized by an extremely high degree of fucosylation. NMR analyses revealed highly fucosylated N-glycan epitopes as Lewisy (Ley) structures, that are typically up-regulated in tumors and important for prognosis. These results represent the first unambiguous characterization of N-type Ley antigens on a specific glycoprotein. Variations of PIP´s glycosylation was analyzed for multiple individuals. An extremely high degree of fucosylation was observed without exception. An inverse correlation between the amounts of fucoses as well as sialic acid residues was detected: The more sialic aids are linked terminally to the N-glycans, the less fucose residues are attached. 40% of all individuals are heterozygous for a nonsynonymous single nucleotide polymorphism (SNP) which causes duplicate signals for the glycoprotein. The amino acid exchange influences the glycosylation pattern: The overall fucosylation is reduced while the overall sialylation is enhanced compared to PIP without the exchange.
Lectin-studies have revealed that Histidine-Rich Glycoprotein (HRG) shows an altered glycosylation during colorectal cancer (CRC). CRC is associated with poor survival rates, typically due to late diagnosis. Diagnostics could be improved, if a simple blood test was available. Here, an isolation strategy for HRG from blood plasma was successfully established by introducing a two-dimensional chromatographic protocol. First analyses show that the glycosylation of HRG possesses a high uniformity between individuals. By plasmin-cleavage of HRG, it was possible to obtain a more site-specific analysis of glycosylation. On that basis, a comparison of HRG glycosylation during non-pathogenic and diseased conditions can be established in order to develop a glyco-based biomarker for CRC.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/7385
URN: urn:nbn:de:gbv:18-87672
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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