Methoden zum Nachweis von Allergenen im Wein

Abstract

Potentiell allergene Proteine aus Hühnerei oder auch aus boviner Milch können für sensitive Verbraucher ein Problem darstellen. Da im Rahmen der Weinproduktion Proteine wie Lysozym aus Hühnerei zur Kontrolle der malolaktischen Gärung oder Ovalbumin beziehungsweise Casein zur Schönung eingesetzt werden, können Rückstände auch im Lebensmittel Wein verbleiben. Die Nutzung von Antikörpern für analytische Zwecke ermöglicht aufgrund der hohen Affinität und Spezifität der Bindung zum entsprechenden Antigen auch den Nachweis von Allergenspuren. Da die Produktion dieser Immunoglobuline jedoch stets Tiere beziehungsweise tierabhängige Methoden beinhaltet und gemäß der aktuellen Gesetzgebung der Einsatz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke reduziert werden soll, wurden in der vorliegenden Arbeit Alternativen entwickelt. Da in den etablierten Methoden der entsprechende Antikörper lediglich einmal eingesetzt werden kann, wurde zur Reduktion des Verbrauches zunächst ein wiederverwendbares System auf Antikörperbasis entwickelt. Durch den Einsatz der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie und Entwicklung einer Regenerationsprozedur ohne Beeinträchtigung der biologischen Aktivität konnte ein wiederverwendbarer Biosensor zur Detektion von Lysozym und Ovalbumin in Weißwein entwickelt werden. Die gesetzlich vorgeschriebenen Anforderungen (0,25 ppm Nachweisgrenze; 0,5 ppm Bestimmungsgrenze) sind durch eine direkte Messung von Proben und entsprechenden Kalibrierstandards innerhalb kürzester Zeit mit minimalem Personalaufwand realisierbar. Um eine vollständige Unabhängigkeit von Antikörpern zu erreichen, wurden auch die Einsatzmöglichkeiten von Aptameren zur Detektion von Allergenen im Kontext Wein untersucht. Diese einzelsträngigen Nukleinsäuren sind aufgrund des fehlenden Komplementärstrangs in der Lage mit unterschiedlichsten Zielmolekülen zu interagieren und werden durch einen Selektionsprozess vollständig in vitro generiert. Unter Nutzung eines teilautomatisierten Selektionsprozesses konnten in der vorliegenden Arbeit mehrere potentielle Sequenzen mit einer Affinität gegenüber Lysozym, Ovalbumin und den bovinen Caseinen identifiziert und in der Folge charakterisiert werden. Unter Berücksichtigung der nanomolaren Dissoziationskonstanten der Aptamer-Target-Komplexe wurden zunächst in Analogie zu den antikörperbasierten Biosensoren entsprechende Aptameranaloga entwickelt. Es zeigte sich bei der Analyse unterschiedlicher Proben, dass die Lysozym- und Ovalbuminaptamere zwar keine absolute Spezifität aufweisen und der Selektionsprozess diesbezüglich optimiert werden sollte, jedoch eine Detektion in Puffer und Realproben möglich ist. Die im Vergleich mit den Antikörpern hohe Stabilität der Nukleinsäuren gegenüber äußeren Einflüssen legt einen Einsatz in Vor-Ort-Methoden wie beispielsweise in LFDs (engl.: lateral flow devices) nahe. Unter Verwendung der selektierten Aptamere mit einer hohen Affinität zu Lysozym konnten entsprechende Systeme entwickelt und zur Detektion in Wein eingesetzt werden, um so beispielsweise die Einhaltung des gesetzlich vorgeschriebenen Höchstwertes (500 ppm) zu überprüfen. Des Weiteren wurden die genannten Aptamere genutzt, um eine bisher nicht in der Literatur beschriebene Möglichkeit der spezifischen Detektion nach einer HPTLC-Trennung (engl.: high performance thin layer chromatography) zu etablieren. Die Detektion unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Aptameren konnte auf unterschiedlichen stationären Phasen erfolgreich durchgeführt werden. Das entwickelte System konnte zur Untersuchung von Realproben und auch zur Beurteilung der Spezifität der Lysozym- und Caseinaptamere genutzt werden, wobei sich zeigte, dass die Lysozymaptamere in diesem Kontext eine hohe Spezifität aufweisen.

Potentially allergenic proteins like lysozyme and ovalbumin originating from hen’s egg or caseins from bovine milk could pose a risk for sensitive individuals. Since these proteins are used during the production of wine for stabilization (fining) or to control malolactic fermentation, residues can also be found in the final product. Multiple analytical methods for the assessment of allergenic risks have been developed under the use of antibodies, since these immunoglobulins are characterized by high affinity and specificity towards the corresponding antigen. A main drawback of antibodies is the production in animals or animal-dependent methods since current legislation demands a minimization of the use of animals for scientific purposes. In the currently established methods, the antibodies are often only used for one time. Therefore, the development of an analytical method using the biological receptors for multiple times could be a contribution to an overall reduction of antibody consumption. Using surface plasmon resonance spectroscopy and a non-denaturating regeneration procedure, it was possible to develop a biosensor for the detection of lysozyme and ovalbumin in white wine. The legislative requirements (limit of detection = 0.25 ppm, limit of quantification 0.5 ppm) are fulfilled by direct measurements without previous steps and on short notice. To reach full independence from antibodies, single-stranded nucleic acids, so-called aptamers, were evaluated regarding the possibility of allergen detection in wine. Therefore, a randomized nucleic acid library was used as starting point for in vitro-selection under white wine mimicking conditions. The selection processes using lysozyme, ovalbumin, and bovine caseins were performed using a semiautomatic procedure and yielded multiple sequences which where characterized afterwards. Using the aptamers which seem to build up the most stable aptamer-target-complexes, it was possible to establish aptamer-based SPR-biosensors with which detection of lysozyme and ovalbumin in white wine could be implemented. The comparably high stability of nucleic acids in comparison to antibodies suggests their use in in-field-methods like LFDs (lateral flow devices). Using the aptamers with an affinity towards lysozyme, it was possible to develop a test system which can be used to detect lysozyme exceeding maximum permissible levels (500 ppm). Furthermore, the identified aptamers have been used for the development of a new method for selective detection after separation via HPTLC (high performance thin layer chromatography). Using fluorescence-labelled aptamers it was possible to perform specific detection on various stationary phases. The procedure was named aptastaining and can be used for analysis of wine samples including a semiquantitative estimation and in addition to determine specificity of the used aptamers. Considering the results gained by the aptamer-based SPR-biosensor and the aptastaining procedures, it became apparent, that the specificity of the identified aptamers significantly depends on the operational purpose. This highlights that the field of application should be taken into account before the selection procedure starts.