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Titel: Modulation of the Unfolded Protein Response by Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus
Sonstige Titel: Modulation der Unfolded Protein Response durch das Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus
Sprache: Englisch
Autor*in: Mousavizadeh, Leila
Schlagwörter: KSHV; IRE1; LANA; Unfolded Protein Response; HHV8
Erscheinungsdatum: 2017
Tag der mündlichen Prüfung: 2017-12-19
Zusammenfassung: 
Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus (KSHV) is a member of the large Herpesviridae family. As with the other family members, two stages to its life cycle have been detected, namely latency and lytic replication. The main state of KSHV is latent infection with only a small population undergoing lytic replication. Most of the viral proteins are expressed during lytic infection which results in the production of progeny virions. Like other viruses, KSHV modulates several cellular signaling pathways for its own benefit. It is known that endoplasmic reticulum (ER) stress and consequently activation of the unfolded protein response (UPR) triggers KSHV lytic infection, however little is published about how KSHV modulates the UPR. Upon accumulation of unfolded and misfolded proteins in the ER (as it can occur during viral infection), cells trigger a signaling pathway in order to restore ER homeostasis, designated as UPR. The UPR consists of three ER-to-nucleus signaling pathways that regulate synthesis, folding, and degradation of proteins in the ER. One of the three UPR sensors, IRE1, activates the transcription factor XBP1, which induces the expression of chaperones and ER-associated degradation factors, thereby alleviating ER stress. Although ER stress can trigger lytic KSHV replication by reactivating the KSHV replication transcription activator factor (RTA) promoter via XBP1s, the effect of KSHV on the UPR is not clearly understood. The aim of this study was to investigate the influence of a lytically replicating KSHV (KSVHLYT) on the UPR via the IRE1 signaling pathway. Here I show that IRE1 protein levels remain largely unchanged at early times but are substantially reduced at late times post infection. Consequently, XBP1s is also decreased during infection. Two cytomegalovirus proteins, M50 and UL50, respectively, have been shown to interact with IRE1 and induce its degradation. However, my experiments show that IRE1 downregulation is not mediated by the ORF67 protein, the homolog of M50/UL50 in KSHV. Instead, IRE1 expression is reduced on the transcriptional level. As KSHV is known to degrade host mRNAs using the viral host shutoff exonuclease, SOX, I constructed a KSHV mutant expressing catalytically inactive SOX. The results indicate that IRE1 is also downregulated in cells infected with the SOX mutant, excluding an effect of the host shutoff in the regulation of IRE1. In contrast, IRE1 levels were not downregulated in cells infected with KSHV mutants containing a deletion of either the latent nuclear antigen (∆LANA) or the viral cyclin (∆vCyclin). Moreover, IRE1 levels were reduced in cells transiently transfected with LANA expression plasmids. Based on these results I hypothesize that LANA downregulates IRE1 to curb RTA expression and promote latency.

Das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV oder Humanes Herpesvirus Typ 8, HHV-8) ist ein großes und komplexes DNA-Virus aus der Familie der Herpesviridae. Wie andere Vertreter der Herpesviren besitzt auch KSHV zwei Phasen der Replikation: die latente und die lytische Phase. Nach Erstinfektion etabliert dieses Virus sehr schnell eine latente Infektion, das vorherrschende Infektionsstadium bei KSHV. Nur ein geringer Prozentsatz der Viren durchläuft eine lytische Replikation, in der fast alle viralen Proteine exprimiert werden. Dies resultiert in der Bildung von Nachkommenviren. KSHV moduliert während einer lytischen Replikation verschiedene zelluläre Signalwege, um seine eigene Replikation zu begünstigen, darunter auch die Signalwege der Unfolded Protein Response (UPR). Die molekularen Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Die UPR wird als Gegenmaßnahme der Wirtszelle aktiviert, wenn die ER-Homöostase durch die Akkumulation von ungefalteten und fehlgefalteten Proteinen im Endoplasmatischen Retikulum (ER) gestört ist, wie es bei einer Virusinfektion geschehen kann. Die UPR umfasst drei Signalwege, die von den ER-Stress-Sensoren ATF6, PERK und IRE1 ausgehen. IRE1 ist der evolutionär konservierteste der drei Signalwege. IRE1 aktiviert den Transkriptionsfaktor XBP1s, der die Expression von Chaperonen und ER-assoziierten Proteindegradierungsfaktoren induziert, wodurch ER-Stress reduziert werden kann. Es ist bereits bekannt, das ER-Stress und die Expression von XBP1s zu einer Reaktivierung durch eine erhöhte Expression des Replikations- und Transkriptionsaktivators (RTA) von KSHV führt. Jedoch ist die Modulation der UPR während der lytischen KSHV-Replikation weitgehend unbekannt. Der Einfluss auf den IRE1-XBP1-Signalweg eines lytisch-replizierenden Virus (KSVHLYT) sollte während meiner Arbeit im Detail untersucht werden. Ich konnte zeigen, dass die IRE1-Proteinlevels zu frühen Zeiten einer KSHV-Infektion unverändert blieben. Zu späten Zeitenpunkten der Infektion, d.h. nach 48-72 Stunden, war IRE1 jedoch stark reduziert, was auch zu einer Reduktion des XBP1s-Proteins führte. Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass Proteine des Cytomegalovirus (M50 bzw. UL50) mit IRE1 interagieren und dessen Abbau induzieren können. Das Homolog von M50/UL50 in KSHV ist das ORF67-Protein. Eine Reduktion von IRE1 durch ORF67 konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Meine Experimente zeigten jedoch, dass KSHV die Expression von IRE1 auf Transkriptionsebene reduziert. Da bekannt war, dass das KSHV mRNAs der Wirtszelle durch das virale Protein SOX (Virus Host-Shutoff Exonuclease) abbaut, wurde eine KSHV-Mutante konstruiert, die ein katalytisch-inaktives SOX-Protein exprimiert. Jedoch konnte kein Effekt der KSHV-SOX-Mutante auf IRE1 identifiziert werden, weswegen ein Effekt des Host-Shutoff bei der Regulation von IRE1 ausgeschlossen wurde. Im Gegensatz dazu konnten die IRE1-Proteinlevels wiederhergestellt werden, wenn Zellen mit zwei KSHV-Mutanten infiziert wurden, denen das latent nuclear antigen (LANA) oder das virale Cyclin fehlt. Außerdem waren die IRE1-Proteinlevels in Zellen reduziert, die transient mit einem LANA-Expressionsplasmid transfiziert wurden. Aus diesen Befunden schließe ich, dass LANA maßgeblich an der Regulation von IRE1 beteiligt ist. Dieser Effekt könnte dazu dienen, die RTA-Expression einzudämmen und somit die Latenz zu fördern.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/7508
URN: urn:nbn:de:gbv:18-89200
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Brune, Wolfram (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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