Novel Insights into Lipoprotein and Hepatitis C Virus Particles Biogenesis and its Dependency on the Lipid Droplet Protein Perilipin 2

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) replication depends on the host cell lipid metabolism with lipid droplets serving as putative viral assembly sites. Lipid droplets are cytosolic organelles consisting of a core of neutral lipids such as triglycerides and cholesterol esters, surrounded by an amphipathic phospholipid monolayer and associated proteins. Perilipin-2 (PLIN2) belongs to the perilipin family of lipid droplet–binding proteins and is the major coat protein of lipid droplets in hepatocytes. In this thesis, the function of PLIN2 on lipid droplet biology and its role in the HCV viral life cycle was investigated. Therefore, shRNA-mediated knockdown experiments were performed to elucidate the molecular function of PLIN2. Silencing of PLIN2 expression had no effect on HCV RNA replication but, in line with the role of lipid droplets in HCV particle assembly, affected the production of infectious viral particles. The reduction in virion production was not caused by a general defect in lipid droplet homeostasis, as the lipid droplet content of the cells and the triglyceride turnover were not affected by PLIN2 knockdown. This was likely due to compensatory functions of PLIN3 that localized to lipid droplets in the absence of PLIN2. However, cells lacking PLIN2 had slightly larger lipid droplets with enhanced lipid droplet–associated lipase activity and displayed a higher ß-oxidation capacity, indicating differences in the fatty acid flux. The enhanced lipolysis rate was in line with a recruitment of the adipose triglyceride lipase (ATGL) complex to lipid droplets of PLIN2-knockdown cells. Lipid droplets isolated from HCV-infected PLIN2-knockdown cells displayed a defect in the recruitment of the capsid protein core to lipid droplets, an important step in the HCV assembly process. In line, slightly less high molecular mass core complexes were found in lipid droplet fractions isolated from PLIN2-depleted cells. More strikingly, cells with diminished PLIN2 levels showed reduced protein expression and secretion of apolipoprotein E (ApoE) due to destabilization of the protein. However, the physical properties and functionality of the remaining ApoE protein seemed to be preserved, as the buoyant density, the interaction with NS5A, as well as the subcellular localization f ApoE was unaffected. The reduced availability of ApoE for virion morphogenesis explains the HCV phenotype. This phenotype cannot be compensated by PLIN3. Thus, PLIN2 is as a major host factor involved in egress of host lipoproteins and functional HCV particles.

Die Hepatitis C Virus Replikation ist eng mit dem Lipidmetabolismus der Wirtszellen verknüpft, wobei Lipid Droplets als Assemblierungsplattform für die Bildung neuer Viruspartikel dienen. Lipid Droplets sind zytosolische Zellorganellen bestehend aus einem Kern aus Neutrallipiden wie Triglyceriden und Cholesterolestern, der von einer amphipathischen einfachen Phospholipidschicht und assoziierten Proteinen umschlossen ist. Perilipin-2 (PLIN2) gehört zu der Perilipin Proteinfamilie der Lipid Droplet Bindeproteine und ist das Hauptprotein an Lipid Droplets in Hepatozyten. In dieser Arbeit wurde die Rolle von PLIN2 in der Lipid Droplet Biologie und im viralen Lebenszyklus von HCV untersucht. Hierfür wurden shRNA-vermittelte Knockdown Experimente durchgeführt, um die Funktion von PLIN2 aufzuklären. Die Herunterregulierung von PLIN2 zeigte keinen Einfluss auf HCV RNA Replikation. Passend zur Rolle der Lipid Droplets als Assemblierungsplattform zeigten PLIN2-knockdown Zellen jedoch eine Reduktion in der Viruspartikel-Produktion. Dieser Phänotyp basierte aber nicht auf einem generellen Defekt in der Lipid Droplet Homöostase, da weder das totale Lipid Droplet Volumen noch der Auf- oder Abbau der Triglyceride durch den PLIN2-knockdown verändert wurden. Diese Beobachtung ist wahrscheinlich durch eine Kompensation mit PLIN3 zu erklären, das in PLIN2-knockdown Zellen zu Lipid Droplets lokalisiert. Zellen mit veringerter PLIN2 Protein Expression hatten geringfügig größere Lipid Droplets, einhergehend mit einer erhöhten Lipid Droplet-assoziierten Lipase Aktivität. Zudem war eine erhöhte ß-Oxidationskapazität zu beobachten, was auf einen veränderten Lipidfluss hindeutet. Die erhöhte Lipolyse war einhergehend mit einer Rekrutierung des Adipose-Triglyceride-Lipase (ATGL) Komplex zu Lipid Droplets in PLIN2- knockdown Zellen. HCV-infizierte PLIN2-knockdown Zellen zeigten zudem einen Defekt in der Rekrutierung des Kapsidproteins Core zu den Lipid Droplets und in der Bildung von Core- Komplexe mit hoher molekularer Masse in Lipid Droplet-Fraktionen. Der größere Phänotyp der PLIN2-knockdown Zellen ist die Destabilisierung des Apolipoprotein E (ApoE). Die Zellen weisen eine deutlich verringerte Menge an intra- und extrazellulärem ApoE auf. Die biophysikalischen Eigenschaften und die Funktionalität des verbliebenen ApoE Proteins blieben jedoch unverändert, da weder die Dichte noch die Interaktion mit dem HCV Protein NS5A oder die subzelluläre Lokalisierung von ApoE verändert waren. Die reduzierte Menge an ApoE erklärt den HCV-Phänotyp, da ApoE ein wichtiger Wirtsfaktor für die Virusmorphogenese ist. Dieser Phänotyp kann nicht durch PLIN3 kompensiert werden. Daher ist PLIN2 ein wichtiger Wirtsfaktor für die Biogenese von Lipoproteinen und funktionaler HCV Partikel.