Potential involvement of Jagged1, integrin alpha5 beta1 and VCAM1 proteins in metastatic progression of human breast carcinomas

Abstract

Breast cancer (BC) is the most frequently diagnosed cancer in women, accounting for 23% of cancer-related diagnoses each year. Metastasis detected at the late stages of disease remains the leading cause of death among BC patients, as limited treatment options are available for these patients. Circulating tumor cells (CTCs) are cells that have detached from primary tumor and are present in blood circulation. Numerous studies have detected CTCs in breast malignancies and showed a close correlation between the presence of CTCs and poor prognosis. Proteins such as Jagged1, integrin alpha5beta1 (ITG α5β1) and Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) have been associated with breast cancer formation and metastasis. Therefore, this study aimed to investigate the expression of these proteins in CTCs, DTCs and/or primary tumors and its clinical relevance in BC patients. 1. Notch pathway is activated in certain tumors, such as BC cells, and seems to be involved in the formation of osteolytic bone metastases (BM) in animal models. Notch ligand Jagged1 is a clinically and functionally important mediator of BM by activating the Notch pathway in bone normal cells. It is reported to be involved in the formation of BM and, therefore, associated with worse prognosis of breast tumor patients. Therefore, in this study, Jagged1 expression was assessed in CTCs of BC patients and compared to clinico-pathological parameters and patients’ outcome. CTCs were enriched from peripheral blood of 100 metastatic patients with progressive disease and detected by pan-keratin/Jagged1/CD45 immunofluorescent staining. 21 metastatic BC patients with progressive disease were positive for CTCs, and 85.7 % of the CTCs also expressed Jagged1. Presence of Jagged1(+) CTCs was significantly associated with shorter progression-free survival in patients treated with bisphosphonates (P=0.013). To conclude, Jagged1 could become an interesting target to monitor bisphosphonate- based therapy response particularly in metastatic patients resistant to this kind of therapy. 2. ITG α5β1 is reported to be expressed in tumor cells and tumor neovessels, facilitating tumor invasion and proliferation. Its overexpression has been associated with worse prognosis and metastatic disease of cancer patients. In this study, ITG α5β1 expression was evaluated by immunohistochemistry on tissue microarrays comprising tumor samples of 411 BC patients and compared to clinico-pathological parameters and patients’ outcome. Additionally, CTCs isolated from peripheral blood of 31 metastatic BC patients and DTCs from the bone marrow of 4 unmatched metastatic BC patients were analysed for ITG α5β1 expression using immunocytochemistry techniques. Not expressed, weak, moderate and strong ITG α5β1 expression was detected in 85 (31.7%), 53 (19.8%), 53 (19.8%) and 50 (18.7%) of 268 informative tumors, respectively. ITG α5β1 expression in primary tumors was significantly associated with M status (p=0.046), micro- and macrometastasis (p=0.007), ALDH1 expression (p=0.023), Jagged1 expression (p=0.025) and presence of DTCs in bone marrow (p=0.035). The expression was neither correlated to shorter disease-free (DFS) and overall survival (OS) in the total patient cohort (p=0.169 and p=0.921 respectively) nor in any other subset of patients. To sum up, Antonia Efstathiou Abstract 4 ITG α5β1 expression characterizes more aggressive breast carcinoma and might be involved in tumor cell dissemination and metastatic progression. However, none of the patients with metastatic BC presented CTCs or DTCs positive for ITG α5β1. 3. VCAM-1 has been associated with early relapse and the activation from tumor cell dormancy. Additionally, blocking of VCAM-1 effectively inhibits metastases formation in the bone marrow or other organs. VCAM-1 expression was assessed in CTCs found in peripheral blood of metastatic BC patients under therapy and correlated to clinical parameters and patients’ outcome. Blood samples from 149 metastatic BC patients were screened for CTCs and VCAM-1. Nineteen of 149 metastatic BC patients were positive for CTCs. Within this group, 11 patients (58.0%) exclusively had VCAM-1(+ )CTCs and 4 patients (21.0%) showed a heterogeneous expression of VCAM-1 in CTCs, whereas 4 patients (21.0%) had only VCAM-1(-) CTCs. VCAM-1 expression in CTCs did not correlate to primary tumor’s characteristics and also did not indicate any specific site of metastases. In conclusion, these results imply that Jagged1, ITG α5β1 and VCAM-1 might play an important role in monitoring breast cancer metastatic disease and have a potential to serve as clinical biomarkers. However, further investigation has to be conducted with respect to the mechanisms of action in tumor cells and cancer therapy.

Brustkrebs gehört mit ~28 % zu der häufigsten Krebserkrankung der Frauen. Die Todesursache bei Krebserkrankungen stellt in der Regel nicht der Primärtumor selbst dar, sondern Metastasen, die sich in der Folge einer Erkrankung ausbilden können. Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind Krebszellen, die sich vom Primärtumor abgelöst haben, in den Blutkreislauf gelangt sind und das Potential besitzen Metastasen zu induzieren. Das Vorkommen von CTCs wurde bei Brustkrebspatientinnen bereits mehrfach mit einer schlechten Prognose assoziiert. Proteine wie Jagged1, Integrin alpha5beta1 (ITG α5β1) und das Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) scheinen zusätzlich prognostische und therapeutisch relevante Informationen für den Verlauf einer Erkrankung aufzeigen zu können. Das Ziel dieser Studie war es die Expression dieser Proteine auf CTCs, DTDs und / oder dem Primärtumorgewebe zu bestimmen, um ihre klinische Relevanz weiter aufzuschlüsseln. 1. Der Notch-Signalweg ist vielfach in Tumoren, wie Brustkrebs aktiviert und wurde bereits im Mausmodell mit osteolytischen Knochenmetastasen in Verbindung gebebracht. Jagged1 fungiert als Ligand für den Notch-Rezeptor und scheint ein funktionell relevanter Mediator für die Knochenmetastasierung zu sein. Dieser Marker wurde zusätzlich bereits mit einer schlechten Prognose assoziiert. Ziel dieser Studie war es die Expression von Jagged1 auf CTCs von Brustkrebspatientinnen zu untersuchen und mit klinisch-pathologischen Parametern zu korrelieren. CTCs wurden aus dem peripheren Blut von 100 Patientinnen mit progressiver, metastastasierter Tumorerkrankung angereichert und über pan-Keratin / Jagged1 / CD45 Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. 21 der untersuchten Blutproben waren positiv für CTCs (21 %), wobei 85,7% der CTCs Signale für die Expression von Jagged1 aufzeigten. Hierbei war die Expression von Jagged1 auf CTCs lediglich bei Patientinnen mit Bisphosphonat-Behandlung zu finden, wobei dieser Marker zusätzlich auch mit einem kürzeren progressionsfreien Überleben in Verbindung gebracht werden konnte (P = 0,013). Jagged1 könnte daher ein interessantes Zielprotein darstellen, um Therapieantworten von Bisphosphonat-behandelten Patientinnen zu verfolgen und insbesondere Resistenzen gegen diese Art von Therapie festzustellen. 2. ITG α5β1 wird in Tumorzellen und Tumor-Neogefäßen exprimiert und scheint für die Tumorinvasion und -proliferation von Bedeutung zu sein. Die Überexpression von diesem Marker konnte bereits mit einer schlechten Prognose und der Metastasierung in Verbindung gebracht werden. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Studie Gewebsproben von 411 Brustkrebspatientinnen untersucht. Des Weiteren konnten CTCs aus peripheren Blutproben von 31 metastasierten Brustkrebspatientinnen isoliert und auf die Expression von ITG α5β1 analysiert werden. In 268 auswertbaren Tumorgewebsproben konnten in 85 Fällen (31,7%) keine ITG α5β1-Signale nachgewiesen werden. 53 (19,8%), 53 (19,8%), und 50 (18,7%) Tumorproben zeigten hingegen eine schwache, mittelstarke und starke Expression dieses Markers. Die ITG α5β1-Expression korrelierte signifikant zu dem M-Status (p = 0,046), dem Mikro- und Makrometastase-Status (p = 0,007), der ALDH1-Positivität (p = 0,023), der Jagged1- Antonia Efstathiou Abstract 2 Positivität (p = 0,025) und dem Auftreten von DTCs im Knochen (p = 0,035). Keine Korrelation konnte hinsichtlich des verkürzten krankheitsfreien Überlebens (DFS) oder des Gesamtüberleben (OS) in der Gesamtkohorte beobachtet werden (p = 0,169 und p = 0,921). Zusammenzufassend lässt sich sagen, dass die ITG α5β1-Expression mit einem aggressiveren Mammakarzinom assoziiert ist und an metastatischen Prozessen beteiligt sein könnte. Jedoch konnte in keiner der Patientinen mit metastasiertem Brustkrebs eine ITG α5β1-Expression auf CTCs nachgewiesen werden. 3. Die Expression von VCAM-1 wurde bereits mit dem Rückfall einer Tumorerkrankung sowie der Tumorzellendormanz in Verbindung gebracht. Zusätzliche Studien haben gezeigt, dass die Hemmung von VCAM-1 die Bildung von Metastasen im Knochenmark und anderen Organen unterdrücken kann. In dieser Studie wurde die VCAM-1-Expression auf CTCs von 149 metastatischen Bruskrebspatientinnen untersucht. Die erzielten Ergebnisse wurden anschließend mit klinischen Parametern verglichen. In 19 von 149 Proben konnten pan-Keratin-postive CTCs nachgewiesen werden. Innerhalb dieser Gruppe zeigten 11 Patientinnen (58,0%) ausschließlich VCAM-1-postive CTCs während 4 Patientinnen (21,0%) eine heterogene Expression aufwiesen. CTCs von 4 weiteren Patientinnen (21,0%) zeigten hingegen keine Signale für die Expression von VCAM-1. Bei der Auswertung der klinischen Daten konnten keine Korrelation zu klinisch-pathologischen Parametern ausfindig gemacht werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass Jagged1, ITG α5β1 und VCAM-1 möglicherweise bei der Bildung von Metastasen eine wichtige Rolle spielen und dadurch ein Potential als klinische Biomarker haben könnten. Jedoch müssten weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Wirkungsmechanismen in Tumorzellen und in der Krebstherapie durchgeführt werden.