Interaktion des Cytomegalovirus mit dem IRE1-abhängigen ER-Stress-Signalweg

Abstract

Eine Aktivierung von IRE1 initiiert das Spleißen der zytosolischen X-Box binding Protein 1 (Xbp1)-mRNA, was zur Translation des Transkriptionsfaktors XBP1s führt. XBP1s startet die Transkription von Proteindegradierungsfaktoren. Unter chronischen Stress Bedingungen kann IRE1 das Adapterprotein TRAF2 rekrutieren und die IRE1-abhängigen Apoptose über den ASK1-JNK-Signalweg aktivieren. Aus diesem Grund kann es für das MCMV vorteilhaft sein die UPR zu modulieren, um eine effiziente Virusreplikation zu gewährleisten und negative Auswirkungen zu blockieren. Die genauen Mechanismen oder welche Virusproteine in der Modulation der UPR eine Rolle spielen ist jedoch weitgehend unbekannt. Zu Beginn der Arbeit konnten bereits publizierte Daten aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass MCMV den IRE1-XBP1-Signalweg zu frühen Infektionsphasen aktiviert. Die Gründe für diese kurzzeitige Aktivierung des Signalweges und die Auswirkungen auf die MCMV-Replikation sollte im ersten Teil der Arbeit näher untersucht werden. Eine genetische Entfernung von IRE1 aus Mausfibroblasten zeigte eine stark reduzierte Replikation und eine verminderte virale Genexpression. Komplementation der IRE1 Knockout (= ko)-Zellen resultierte in einer vollständigen Wiederherstellung der viralen Replikation. Der Knockout anderer Komponenten des IRE1-Signalweges, XBP1 oder TRAF2, hatten keinen Einfluss. IRE1 ko- und XBP1 ko-Zellen unterscheiden sich in zweierlei Hinsicht: die Anreicherung des ungespleißten XBP1-Proteins (XBP1u) in IRE1 ko- und das Fehlen einer XBP1-Experssion in XBP1 ko-Zellen. Um den Einfluss der erhöhten XBP1u Expression auf die MCMV-Replikation zu analysieren wurden XBP1-defiziente Zellen mit einer „unspleißbaren“ Xbp1-mRNA komplementiert. Diese Überexpression von XBP1u führte zu einer stark verminderten Replikation. Außerdem wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass der Knockout des ATF6α keine Auswirkung auf die virale Replikation und Genexpression hatte. Ein ATF6α/XBP1-Doppleknockout führte jedoch zu einem ähnlichen inhibierenden Effekt auf die MCMV-Replikation wie die Infektion der IRE1 ko-Zellen. Zusammenfassend konnten die Daten das XBP1u-Protein als Repressor der viralen MCMV-Replikation identifizieren. Somit konnte erstmals gezeigt werden, dass das MCMV die kurzzeitige Aktivierung des IRE1-XBP1-Signalwegs initiiert um seine eigene virale Replikation zu begünstigen und die negativen Folgen einer XBP1u-Anreicherung zu unterdrücken. Das MCMV-Protein M50, Interaktionspartner von M53 und essentielle Komponente im Kernausschleusungskomplex, interagiert mit dem UPR-Sensor IRE1 zu späten Zeitpunkten der Replikation. Diese Interaktion führt zum Abbau des IRE1-Proteins und zur Inhibierung des Xbp1-mRNA Spleißens. Aufbauend auf den publizierten Daten unserer Arbeitsgruppe sollte im zweiten Teil dieser Arbeit eine minimale M50-Domäne identifiziert werden, welche für die IRE1-Interaktion und -Degradierung verantwortlich ist. Das Ziel war eine funktionelle Trennung der zwei M50-Funktionen: IRE1-Interaktion/-Degradierung und M53-Interaktion. Darüber hinaus sollte der M50-vermittelte IRE1-Abbaumechanismus aufgeklärt werden. Mit verschiedenen generierten M50-Mutanten konnte eine 5-Aminosäure kleine Region im M50 identifiziert werden, der für den IRE1-Abbau verantwortlich ist. Diese Mutation hatte keinen Einfluss auf die M50-IRE1-Interaktion. Rekonstitution einer M50-Virusmutante mit dem identifizierten Bereich war jedoch nicht möglich. Bestätigend hierfür konnte nur eine extrem schwache M53-Interaktion der M50-Mutante in Transfektion nachgewiesen werden. Die M50-M53-Interaktion ist für die Virusreplikation essentiell. Dementsprechend konnte keine weitere Charakterisierung und Auswirkung einer fehlenden IRE1-Degradierung auf die MCMV-Replikation erfolgen. Der M50-vermittelte IRE1-Abbaumechanismus wurde erfolgreich aufgeklärt und als proteasomal-abhängiger Mechanismus identifiziert. Eine Applikation verschiedener proteasomaler Inhibitoren wie MG132 konnte die IRE1-Expression in Transfektions- und Infektionsexperimenten wiederherstellen. Außerdem konnten Co-IP-Experimente zeigen, dass das IRE1-Protein durch die M50-Interaktion mit Ubiquitin markiert wird. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass eine Trennung der zwei M50-Funktionen, auch nach Identifizierung einer minimalen Mutation im M50-Protein, nicht möglich war. Außerdem wird der IRE1-Abbau durch die Markierung des IRE1 mit Ubiquitin und anschließende proteasomale Degradierung durch das virale Protein M50 vermittelt.

During viral infection, a massive demand for viral glycoproteins can overwhelm the capacity of the protein folding and quality control machinery, leading to an accumulation of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER). To restore ER homeostasis, cells initiate the unfolded protein response (UPR) by activating three ER-to-nucleus signaling pathways, of which the inositol-requiring enzyme 1 (IRE1)-dependent pathway is the evolutionary most conserved. Once activated, IRE1 splices the X-box binding protein 1 (XBP1) mRNA, leading to translation of the transcription factor XBP1s. In addition, IRE1 can recruit TRAF2 to activate JNK. Cytomegaloviruses, as other viral pathogens, modulate the UPR to their own advantage. However, the molecular mechanisms and the viral proteins responsible for UPR modulation remain poorly defined. Previous studies of our group have shown that murine cytomegalovirus (MCMV) briefly activates the IRE1-XBP1 signaling pathway immediately after infection. Therefore, a detailed investigation of the impact of the IRE1-dependent signaling on murine cytomegalovirus (MCMV) infection and the answer why MCMV activates the IRE1-XBP1 pathway was the first part of this work. Genetic inactivation of IRE1 in murine embryonic fibroblasts resulted in reduced expression of viral proteins and a strong inhibition of viral replication, suggesting that IRE1 signaling is important for the viral life cycle. Re-introduction of IRE1 using a doxycycline-inducible system restored viral replication in a dose-dependent manner up to wildtype levels. By contrast, genetic ablation of XBP1 or TRAF2 had only minor effects on viral productivity. XBP1 and IRE1 knockout cells differ in that XBP1 ko cells express neither the spliced nor the unspliced XBP1 protein whereas IRE1 ko cells express only the unspliced XBP1 (XBP1u). To test whether XBP1u represses MCMV replication, expression of an “unspliceable” Xbp1-mRNA in XBP1 KO cells reduced MCMV replication massively. Moreover, this work shows that the knockout of ATF6 had no effect on viral replication but a double knockout of ATF6 and XBP1 did which further suggests an involvement of XBP1u as a potent repressor of MCMV replication. This data shows for the first time that MCMV activates the IRE1-XBP1 pathway to benefit its own replication and to avoid negative consequences by the translation of the XBP1u protein. Previous studies of our group have shown that the MCMV nuclear egress protein M50 interacts and downregulates the conserved UPR sensor IRE1 during late stages of infection. The precise domain for the reducing function and the mechanism of how M50 reduces IRE1 protein level is not yet known. The second part of this work was to find a minimal domain in the M50 protein which is responsible for IRE1 interaction and downregulation. The goal was to separate the two functions of the M50 protein: 1. IRE1 interaction/downregulation and M53 interaction, which is an essential part in the nuclear egress of viral capsids during MCMV replication. Moreover, the M50-dependent mechanism of IRE1 protein degradation remains to be identified. It was possible to define a small 5 amino acids region in the M50 conserved domain to be responsible for the downregulation of IRE1. Mutation of these 5 amino acids had no influence on the IRE1-M50 interaction. Moreover, introduction of this mutation into the BAC-derived M50 gene using En passant mutagenesis resulted in no virus reconstitution. In addition, Co-IP experiments could show that the plasmid-derived M50 mutant interacted very poorly with the viral protein M53. The interaction between M50 and M53 is essential to form the nuclear egress complex during MCMV replication and therefore a crucial step to produce new virus progenitors. Furthermore, it was shown that the reduction of IRE1 protein levels by M50 is dependent on the proteasomal pathway. Treatment of IRE1/M50 co-transfected or MCMV infected cells with various proteasomal inhibitors like MG132 or Lactacystein could restore IRE1 expression in a dose and time dependent manner. The mechanism of IRE1 downregulation is not only dependent on the proteasome. It could also be demonstrated that IRE1 is modified by ubiquitin. In summary, this data suggest that the two functions of M50 cannot be separated from each other. Moreover, it was shown for the first time that the M50 dependent IRE1 downregulation is mediated by IRE1 ubiquitination and proteasomal degradation. Still, there are some open questions which need to be answered by follow up experiments to complete the model of IRE1 downregulation by the viral protein M50.